Identifizierung von Pflanzenproteinen durch die Bewertung der Eis-Rekristallisation Hemmung und Isolation Mit Ice-Affinitätsreinigung Ice-Bindung

Eis-bindenden Proteine (IBPs) sind eine mannigfaltige Familie von Schutzproteinen , die in einer Reihe von Organismen , einschließlich Pflanzen , ^{1, 2} Insekten, Fischen ³ und ⁴ Mikroben entdeckt wurden. Das Hauptmerkmal dieser Proteine ​​ist ihre einzigartige Fähigkeit, gezielt und effizient zu Eiskristallen, zu modifizieren ihr Wachstum zu adsorbieren. IBPs haben mehrere dokumentierten Eigenschaften, mit den beiden am besten charakterisierten sind thermische Hysterese (TH) und Eis-Rekristallisation Hemmung (IRI). TH-Aktivität wird leichter in IBPs beobachtet in gefrier intolerant Tieren. Diese Aktivität führt zu einer Absenkung des Gefrierpunktes von Organismen Kreislauf- oder interstitiellen Flüssigkeiten Einfrieren zu verhindern. Im Gegensatz dazu in gefriertoleranten Organismen, die bei Temperaturen unter Null zwangsläufig einfriert, erscheint IBPs niedrig TH-Aktivität zu haben. Trotz der geringen TH-Aktivität, eine hohe Aktivität IRI Eis Schrei zu beschränkenStal Wachstum wird oft mit diesen Proteinen beobachtet. Für die Gefrieren tolerant Organismus, dies vermutlich IRI Aktivität hilft Zellen aus dem unkontrollierten Wachstum von Eis in extrazellulären Kompartimenten zu schützen.

Das „Matratze Schaltfläche“ Modell kann verwendet werden , um den Mechanismus zu beschreiben , durch die IBPs das Wachstum von Eiskristallen zu verhindern ^5. Nach diesem Modell adsorbieren IBPs spezifisch an die Oberfläche von Eiskristallen in Intervallen, so dass Wassermoleküle nur mit den wachsenden Eiskristallen Gittern in dem Raum zwischen gebundener IBPs integrieren. Dadurch entsteht eine Krümmung auf, die der Einbau von zusätzlichen Wassermolekülen ungünstig, ein Ereignis macht, die von dem Gibbs-Thomson – Effekt ⁶ beschrieben werden kann. Die verankerte Clathrat Wasser Hypothese stellt einen Mechanismus für die spezifische Bindung von IBPs zur Eiskristall Oberfläche, wobei die Anwesenheit von geladenen Resten, insbesondere auf der Protein-Bindungsstelle Eis positioniert ist, ergibt die REOrganisation von Wassermolekülen , so passen sie einer oder mehreren Ebenen des Eises Kristallgitter ^7.

TH-Aktivität kann durch Messen der Differenz zwischen dem Schmelz- und Gefriertemperaturen eines einzelnen Eiskristall in Gegenwart eines IBP quantifiziert werden. Während TH-Aktivität ein weithin akzeptiertes Verfahren zum Bewerten der Aktivität von IBPs, der niedrigen TH Spalte durch Pflanzen IBPs hergestellt (in der Regel nur einen Bruchteil eines Grades), die normalerweise erfordert eine hohe Proteinkonzentration, spezialisierte Ausrüstung und Erfahrung des Bedieners. Obwohl nicht-IBPs Eiskristallwachstum beschränken kann, ist es eine Eigenschaft von allen IBPs geteilt und damit für IRI Aktivitätstest wird ein effektiver Anfangsbildschirm für die Anwesenheit von IBPs, insbesondere für diejenigen mit geringer TH-Aktivität. Das verwendete Verfahren, diese Aktivität zu testen, wird als ‚Splat-Tests‘ bekannt, wobei eine Proteinprobe schockgefroren wird eine Monoschicht von kleinen Eiskristallen zu erzeugen, die sie über einen Zeitraum beobachtet werden, um zu bestimmen, obEiskristallwachstums eingeschränkt. Im Gegensatz zu anderen Methoden verwendet, um eine Quelle Gewebeprobe auf das Vorhandensein von IBPs zu screenen, diese Technik zu geringen Proteinkonzentrationen im Bereich von 10-100 ng anwendbar ist, nutzt leicht fabrizierten Ausrüstung, und erzeugt Daten, die schnell und einfach interpretiert wird. Jedoch ist es wichtig zu betonen, dass dieser Test eine Anfangsbildschirm für IBPs bereitstellt, die durch die Bestimmung von TH und Eiskristall Formgebung gefolgt werden soll.

Die Isolierung von nativen Proteinen ist eine Herausforderung und erfordert häufig Informationen über die strukturellen und biochemischen Eigenschaften eines Proteins von Interesse. Die Affinität von IBPs für Eis ermöglicht die Isolierung dieser Proteine ​​Eis als Substrat für Reinigungszwecke verwendet wird. Da die Mehrzahl der Moleküle vor der Eis-Wasser-Grenze während des Wachstums von Eiskristallen, langsamem Wachstum einer Eis-Hemisphäre in Gegenwart einer IBP Probe ergibt eine hochgereinigte Probe geschoben, ohne großen quantities von Proteinen und gelöste Stoffe zu kontaminieren. Diese Methode wurde verwendet IBPs von Insekten ⁸ zu ^{identifizieren, 9, 10, 11} Bakterien, Fisch und Pflanzen ^{12 13, 14.} Zusätzlich können die IBP-angereicherten Fraktionen durch diese Methode erreicht auch für nachgelagerte biochemische Analyse verwendet werden. Dieses Papier beschreibt die Identifizierung von IBPs in Pflanzen durch die Induktion und Extraktion von IBPs, die Analyse von IRI Aktivität die Anwesenheit von Proteinen und die Isolierung von Proteinen unter Verwendung von Eis Affinitätsreinigung zu bestätigen.