식물은 아이스 친화 정제를 사용하여 얼음의 재결정 억제 및 절연의 평가를 통해 단백질을 아이스 결합의 식별
Summary
이 논문은 얼음 재결정 억제 활성과 얼음 화성 정제를 사용하여 원시 IBPS의 후속 분리의 평가를 통해 동결 내성 식물 얼음 – 결합 단백질의 동정을 설명합니다.
Abstract
얼음 – 결합 단백질 (IBPS)이 영하의 온도에 노출 특정 미생물에 의해 합성되어 스트레스 – 유도 단백질의 패밀리에 속한다. 세포 외 얼음 결정이 성장하면 식물에서 동결 손상은 세포막 가능한 세포 죽음의 파열의 결과로 발생합니다. 얼음 결정으로 IBPS의 흡착되어 세포 손상을 감소 얼음 재결정 억제 (IRI)으로 알려진 공정에 의해 상기 성장을 제한한다. IBPS은 평형 융점 이하 용액, 열 이력 (TH) 활성 알려진 속성의 빙점을 누를 수있는 능력을 입증한다. 이러한 보호 특성으로 인해, 산업, 의료 및 농업 분야에서 자신의 잠재적 인 사용에 새로운 IBPS의 식별에 대한 관심을 제기했다. 이 논문은 1 내지 IBPS 공장의 식별) 유도 추출 IBPS의 식물 조직에서, 2) IRI 활성에 대한 스크리닝 추출물, 3)을 정제 및 분리를 설명IBPS의 가스화. 낮은 온도에 노출하여 IBPS 유도 후, 추출물을 표준 광학 현미경을 이용하여 얼음 결정 성장을 관찰 할 수있는 '플랫 분석'을 이용 IRI 활성에 대해 시험된다. 이 분석은 낮은 단백질 농도가 필요하며 빠르게 수득 쉽게 얼음 결합 활성의 초기 화면을 제공하고, 해석 결과를 생성한다. IBPS이어서 '얼음 화성 정제'이라는 기술을 통해 얼음을 흡착 IBPS의 속성을 이용하여 단백질을 오염으로부터 격리 될 수있다. 식물 추출물에서 수집 한 세포 용 해물을 사용하여, 얼음 반구 천천히 황동 프로브에 성장시킬 수있다. 이는 다결정 얼음의 결정 구조에 IBPS를 통합합니다. 아니오 IBP의 선험적 생화학 적 또는 구조적 기술을 요구하는이 방법은 단백질의 활성 회복을 허용한다. 아이스 정제 단백질 분획 격려의 식별을 포함하여 다운 스트림 응용 프로그램을 사용할 수 있습니다질량 분석 및 천연 단백질의 생화학 적 분석에 의한 조수 시퀀스.
Introduction
ICP (Ice-binding proteins)는 식물 1 , 곤충 2 , 어류 3 , 미생물 4 등 여러 유기체에서 발견 된 다양한 보호 단백질 군입니다. 이 단백질의 핵심 특징은 얼음 결정에 특이하고 효율적으로 흡착되어 성장을 수정하는 독특한 능력입니다. IBP는 몇 가지 문서화 된 성질을 가지고 있는데, 가장 잘 특징 지어지는 두 가지는 열 히스테리시스 (TH)와 얼음 재결정 억제 (IRI)입니다. TH 활성은 동결 – 내성이없는 동물에서 생산 된 IBP에서보다 쉽게 관찰된다. 이 활동으로 인해 동결을 방지하기 위해 유기체의 순환 또는 간질 유체의 응고점이 낮아집니다. 대조적으로, 영하의 온도에서 필연적으로 동결 될 동결 내성 유기체에서, IBPs는 TH 활성이 낮게 나타난다. 낮은 TH 활동에도 불구하고, 얼음 울기를 제한하는 높은 IRI 활동STAL 성장은 종종 이러한 단백질과 관찰된다. 동결 내성 미생물의 경우,이 IRI의 활동은 아마도 세포 외 구획 얼음의 조절되지 않는 성장 세포를 보호하는 데 도움이됩니다.
은 "매트리스 버튼"모델 IBPS 얼음 결정 (5)의 성장을 방지하는 메커니즘을 설명하는 데 사용될 수있다. 이 모델에서는 IBPS 특히 물 분자에만 결합 IBPS 사이의 공간에 성장 얼음 결정 격자로 통합 할 수 있도록 간격으로 얼음 결정 표면에 흡착. 이 부가 물 분자의 결합이 불리하게 곡률, 깁스 – 톰슨 효과 (6)에 의해 설명 될 수있는 이벤트를 생성한다. 앵커 포접 물 가설 얼음 결정 표면에 IBPS의 특이 적 결합을위한 메커니즘을 제공 됨으로써 REO에 특이 단백질 결합 부위 얼음에 위치 대전 잔기의 존재는 결과물 분자가 얼음 결정 격자의 하나 이상의 평면과 일치하도록한다.
TH 활성은 IBP의 존재하에 단일 빙 결정의 용융 및 응고 온도의 차이를 측정함으로써 정량화 될 수있다. TH 활성은 IBP의 활성을 평가하는 널리 받아 들여지는 방법이지만, 식물 IBP에 의해 생성되는 낮은 TH 갭 (일반적으로 단지 일부 정도)은 일반적으로 높은 단백질 농도, 특수 장비 및 조작자 경험을 필요로한다. 비 IBP는 얼음 결정 성장을 제한 할 수 있지만 모든 IBP가 공유하는 특성이므로 IRI 활동에 대한 테스트는 IBP의 존재에 대한 효과적인 초기 화면, 특히 TH 활동이 낮은 사람들을위한 효과적인 초기 화면입니다. 이 활동을 테스트하는 데 사용되는 방법론은 'splat assay'로 알려져 있으며, 단백질 샘플을 얼음으로 얼려서 작은 얼음 결정의 단일 층을 생성하고 일정 기간 동안 관찰하여얼음 결정 성장이 제한됩니다. IBPS 존재하는 소스 조직 샘플을 스크리닝하는데 사용하는 다른 방법과는 달리,이 기술은 10-100 ng의 범위의 낮은 단백질 농도에 적용 가능하다 쉽게 제작 된 장비를 이용하여, 신속하고 간편하게 해석 데이터를 생성한다. 그러나, 상기 분석은 TH 결정 얼음 결정 형성 와야 IBPS위한 초기 화면을 제공하는 것을 강조하는 것이 중요하다.
천연 단백질의 분리는 종종 관심의 단백질의 구조적, 생화학 적 특성에 관한 정보를 필요로 도전하고있다. 아이스 IBPS의 친화 정제 목적을 위해 기판으로서 아이스를 사용하여 이러한 단백질의 격리를 허용한다. 분자의 대부분이 얼음 결정 성장, 고도로 정제 된 샘플의 IBP 샘플 결과의 존재 하에서 얼음 반구 저성장 큰 quantit없는 동안에 앞서 빙수 경계 가압되므로단백질 및 용질을 오염 IES. 이 방법은 곤충, 8, 9, 10, 11 박테리아, 식물 및 어류 12 13 14 IBPS를 식별하는데 사용되었다. 또한,이 방법을 통해 달성 IBP – 풍부 분획은 또한 하류 생화학 적 분석에 이용 될 수있다. 이 논문은 IBPS 유도 추출 통해 식물 IBPS의 식별을 설명, IRI 활동 분석은 단백질의 존재 및 얼음 친 화성 정제를 사용하여 단백질의 분리를 확인한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
IBPS의 성공적인 분석 및 정제를 들어,이 단백질의 일부의 온도에 민감한 특성을 이해하는 것이 중요합니다. 특정 식물 IBPS는 전개, 침전 및 활동의 결과로, 0 ° C 이상의 온도에서 불안정해질. IBPS 활성을 얻기 위해서는 식물은 냉장실 (~ 4 ° C)에서 처리되고, 샘플은 실험하는 동안 얼음에서 유지되는 것이 종종 중요하다. 전체 셀 원유 해물을 사용하여 내생 단백질 분해 효소에 의한 단백질의 분해?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 VKW에 NSERC (캐나다) 부여에 의해 투자되었다.
Materials
| 1.5 mL microcentrifugetubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Adjustable lab jack | Fisher | S63080 | |
| Benchtop centrifuge | Desaga MC2 | ||
| Brass probe | Custom built | ||
| Camera/ camera port | Canon | Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port | |
| Cheesecloth | Purewipe/Fisher Scientific | 06-665-25A | |
| Concentration tubes (0.5 mL) | EMD Millipore | UFC501008 | |
| Concentration tubes (15 mL) | EMD Millipore | UFC900308 | |
| Conical tubes (50 mL) | Thermo Fisher | AM12502 | |
| Cooling block | VWR | 13259 | Use a metal heating block |
| Dehumidifier | Whirlpool | 50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier | |
| Dessciation beads | t.h.e. Dessicant/VWR | EM-DX0017-2 | 6-8 mesh size; 100% indicating |
| Dissection microscope | Olympus Tokyo | ||
| Double walled glass bowl | Generic | Purchase from local lab glassware supplier | |
| Dry ice | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| EDTA-protease inhibitor tablets | Sigma Aldrich | 11836170001 | Roche cOmplete mini |
| Ethylene glycol | Generic | Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (i.e. Home Depot) | |
| Hexane | Sigma Aldrich | 296090 | Anhydrous, 95%; hazardous |
| Immersion oil | Sigma Aldrich | 56822 | |
| JA10/20 centrifuge | Beckman | ||
| Large plastic petri dish | Generic | ||
| Liquid nitrogen | Generic | Use local supplier; hazardous | |
| Magnetic stir plate | Hanna Instruments | HI190M | |
| Microscope cover slides | Fisher | 12-542A | |
| Plastic tube | Generic | Purchase PVC pipe from local hardware store | |
| Polarized film | Edmund Optics | 43-781 | |
| Polystyrene foam | Generic | Can be constructed from polystyrene shipping boxes | |
| Poreclain mortar and pestle | Fisher | FB961 | |
| PVPP | Sigma Aldrich | 77627 | 110 µm particle size |
| Retort Stand | Fisher | 12-000 | |
| Small stir bar | Fisher | 14-513-51 | |
| Temperature-programmable water bath | VWR | 13271-118 | |
| Vacuum grease | Dow Corning/Sigma Aldrich | Z273554 | |
| Vinyl tubing | Generic |
Referências
- Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256 (2000).
- Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
- Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
- Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
- Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
- Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461 (2005).
- Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
- Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
- Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805 (2012).
- Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153 (2004).
- Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
- Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
- Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
- Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
- Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
- Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
- Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
- Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692 (2015).
- Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
- Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
- Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
- Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185 (2014).
- Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
- Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).
