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Imunologia e Infecção

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

Published: August 15, 2017
doi:
10.3791/55301
, ,
1Department of Biochemistry and Cell Biology,State University of New York, 2Department of Plant Pathology and Plant-Microbe Biology,Cornell University

Summary

Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

Abstract

Plasmodesmos (Pd) son las conexiones de la célula a célula que funcionan como puertas de enlace a través del cual se transportan las moléculas grandes y pequeñas entre las células vegetales. Considerando que el transporte de Pd de pequeñas moléculas, como iones y agua, se presume para ocurrir pasivamente, transporte célula a célula de las macromoléculas biológicas, tales proteínas, probablemente se produce mediante un mecanismo activo que involucra señales específicas de focalización en la molécula transportada. La escasez de señales de localización identificados plasmodesmos (Pd) (PLSs) ha restringido severamente la comprensión de la proteína-clasificación vías implicadas en la planta transporte macromolecular de la célula a célula y la comunicación. De una amplia variedad de plantas endógenas y virales proteínas conocidas al tráfico a través de la Pd, PLSs sólo tres han divulgado hasta la fecha, todas ellas de proteínas endógenas de la planta. Por lo tanto, es importante desarrollar una estrategia experimental confiable y sistemática para identificar una secuencia funcional de PLS, que es necesario y suficiente para apuntar Pd, directamente en la vida de las células de la planta. Aquí, describimos una estrategia de este tipo utilizando como paradigma de la proteína de movimiento célula a célula (MP) del virus del mosaico del tabaco (TMV). Estos experimentos, que identificaron y caracterizaron el primer planta PLS viral, puede ser adaptados para el descubrimiento de secuencias PLS en proteínas más orientada a Pd.

Introduction

Plasmodesmos (Pd) funcionan como conductos para el transporte intercelular de los reguladores claves del desarrollo de la planta y la morfogénesis, que van desde factores de transcripción a ARNm y pequeñas moléculas de ARN. Además, esta capacidad de transporte macromolecular de la EP es utilizada por la mayoría virus de planta para su diseminación intercelular durante la infección; para desplazarse por Pd, virus de plantas han evolucionado las proteínas especializadas, como proteínas de movimiento (MPs), que se dirigen específicamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vías moleculares de transporte Pd probablemente están íntimamente interconectadas con las secuencias específicas que atacan las proteínas transportadas en estas vías. Así, la identificación de estas señales de localización de Pd (PLSs) puede ser diagnóstico de la vía de transporte Pd correspondiente. Esto es por analogía de Pd transporte8, por ejemplo, la importación nuclear diferentes caminos, que pueden ser específicos para diferentes localización nuclear (NLS) de señal secuencias9,10. Conceptualmente, la NLSs y PLSs representan no escindibles subcelulares dirigidos a secuencias necesarias y suficientes para dirigir. Sin embargo, a diferencia de la NLSs11, la información de la secuencia sobre PLSs es severamente limitada. Específicamente, solamente cuatro secuencias de la proteína involucradas en la orientación de la Pd se han divulgado, con todos ellos derivados de proteínas endógenas de la planta. La primera está representada por un dominio de homeobox de KN112 – un factor de transcripción que se desplaza de las capas internas de la célula a la epidermis de la planta hoja13 – y sus homólogos de KNOX14. El segundo también es de un factor de transcripción, Dof, que contiene una supuesta PLS calificó el tráfico intercelular (IT) tema15. Es la tercera secuencia de la proteína de membrana de PDLP1 residente en plasmodesmos tipo 1, y está representado por un dominio transmembrana16. Por último, el cuarto Pd a secuencia fue divulgado recientemente de glicosilfosfatidilinositol (GPI)-proteínas ancladas y está representada por la modificación de glicosilfosfatidilinositol (GPI) señal17.

Curiosamente, hasta hace poco, no PLSs se han divulgado para MPs virales. Estudios previos indicaron la presencia de supuestas secuencias PLS en planta MPs virales18,19, pero no verdadera PLS, es decir, una secuencia de aminoácidos mínimo necesaria y suficiente para Pd contra una carga sin relación () molécula e.g., PPC) ha sido identificada en un MP viral. Sin embargo una de estas proteínas, MP del virus del mosaico del tabaco (TMV), fue el primero que Pd localización y transporte han sido demostrado20.

Para hacer frente a este vacío, hemos desarrollado una estrategia experimental para identificar TMV MP PLS. Esta estrategia se basa en tres conceptos. (i) define PLS como una secuencia de aminoácidos mínimo que es necesario y suficiente para apuntar de la proteína a Pd21. (ii) porque la MP del TMV Pd se dirige primero y luego se transloca a través de estos canales22, apuntamos a desacoplar estos dos actividades e identificando el PLS de buena fe, que funciona sólo para apuntar Pd y no para el transporte posterior. (iii) se analizaron PLS identificado para residuos de aminoácidos importantes para su EP dirigidos a la actividad, ya sea estructural o funcional. Usando este acercamiento, delineó una secuencia 50-amino ácida del residuo en el amino terminal de la MP del TMV que actúa como auténtico PLS. Esto se hace produciendo una serie de fragmentos de la MP del TMV que satura toda la longitud de la proteína, marcado su carboxilo-termini con PPC y transitoriamente expresarlos en los tejidos vegetales. Localización de la PD de cada uno de los fragmentos prueba determinó coexpressing con una proteína del marcador de Pd, PDCB1 (proteína 1 de Unión Callosa Pd)23. El fragmento más pequeño que todavía había localizado en Pd, pero no lo hizo atravesar Pd, era considerado para representar PLS. Finalmente, lo PLS fue alanina-explorado para determinar los residuos de aminoácidos clave para su estructura o función.

Mientras que aquí ilustramos este enfoque describiendo la identificación de la MP del TMV PLS, pueden ser empleado para descubrir PLSs en cualquier otras proteínas orientada a Pd, ya sea codificado por patógenos o por las plantas Esto es porque nuestro método no aprovechar cualquier características únicas de las MPs virales con respecto a su capacidad de destino a Pd.

Protocol

1. Material vegetal Elección de especies vegetales Uso de la especie de planta nativa de la proteína de interés, es decir, uno que codifica esta proteína proteínas endógenas o que representa el huésped natural para el patógeno para las proteínas virales. Además, las especies seleccionadas deben ser susceptibles del elegido método de transformación genética transitoria.Nota: Los estudios emplean rutinariamente Nicotiana benthamiana, que representa un buen anfitrión p…

Representative Results

Los datos representativos, que fielmente ilustran los resultados esperados de los protocolos descritos e identifican la TMV MP PLS, se adaptan de Yuan et al. 21. figura 1A resume primero principales construcciones expresando el MP de TMV larga duración (1-268), TMV MP PLS (formada por los primeros 50 residuos de aminoácidos de la proteína, 1-50), y la alanina análisis derivados de V4A fusionado al CFP (generado como se describe en paso…

Discussion

Este protocolo tiene cuatro componentes fundamentales: el concepto de identificación de una secuencia que es necesario y suficiente para apuntar a Pd, división sistemática de la proteína de interés en los fragmentos que se reducen progresivamente en longitud, la prueba de fusión fragmentos de una proteína autofluorescent que sirve como etiqueta y como carga macromolecular y análisis funcional de EP objetivo en la vida de la planta tejidos después de la expresión transitoria de las proteínas de fusión probado….

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La falta de espacio, hemos citado sobre todo artículos de revisión, y pedimos disculpas a nuestros colegas cuyo trabajo original no fue citado. El trabajo en el laboratorio de V.C. es apoyado por becas del NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD y BSF a V.C., y el laboratorio de SGL es apoyado por los NIH y los fondos de los departamentos de Fitopatología y biología planta-microorganismo a SGL

Materials

Confocal laser scanning microscope (CLSM) Zeiss LSM5 Any CLSM with similar capabilities is appropriate
Zen software for confocal microscope imaging Zeiss 2009 version The software should be compatible with the CLSM used
Quickchange II site-directed mutagenesis kit  Agilent 200523
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES Sigma-Aldrich 69892
Syringes without needles BD 309659
MgCl2 FisherScientific M33-500
Spectinomycin  Sigma-Aldrich S4014
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501
Ampicillin  Sigma-Aldrich A0166
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Referências

  1. Lee, J. Y. Plasmodesmata: a signaling hub at the cellular boundary. Curr. Opin. Plant Biol. 27, 133-140 (2015).
  2. Kumar, D., Kumar, R., Hyun, T. K., Kim, J. Cell-to-cell movement of viruses via plasmodesmata. J. Plant Res. 128, 37-47 (2015).
  3. Kitagawa, M., Paultre, D., Rademaker, H. Intercellular communication via plasmodesmata. New Phytol. 205, 970-972 (2015).
  4. Jackson, D. Plasmodesmata spread their influence. F1000Prime Rep. 7, 25 (2015).
  5. Brunkard, J. O., Runkel, A. M., Zambryski, P. C. The cytosol must flow: intercellular transport through plasmodesmata. Curr. Opin. Cell Biol. 35, 13-20 (2015).
  6. Yadav, S. R., Yan, D., Sevilem, I., Helariutta, Y. Plasmodesmata-mediated intercellular signaling during plant growth and development. Front. Plant Sci. 5, 44 (2014).
  7. Sager, R., Lee, J. Y. Plasmodesmata in integrated cell signaling: insights from development and environmental signals and stresses. J. Exp. Bot. 65, 6337-6358 (2014).
  8. Jans, D. A., Xiao, C. Y., Lam, M. H. Nuclear targeting signal recognition: a key control point in nuclear transport?. BioEssays. 22, 532-544 (2000).
  9. Miyamoto, Y., et al. Different modes of nuclear localization signal (NLS) recognition by three distinct classes of NLS receptors. J. Biol. Chem. 272, 26375-26381 (1997).
  10. Nair, R., Carter, P., Rost, B. NLSdb: database of nuclear localization signals. Nucleic Acids Res. 31, 397-399 (2003).
  11. Lee, J. Y., Yoo, B. C., Lucas, W. J. Parallels between nuclear-pore and plasmodesmal trafficking of information molecules. Planta. 210, 177-187 (2000).
  12. Kim, J. Y., Rim, Y., Wang, J., Jackson, D. A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes Dev. 19, 788-793 (2005).
  13. Lucas, W. J., et al. Selective trafficking of KNOTTED1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science. 270, 1980-1983 (1995).
  14. Chen, H., Jackson, D., Kim, J. Y. Identification of evolutionarily conserved amino acid residues in homeodomain of KNOX proteins for intercellular trafficking. Plant Signal. Behav. 9, e28355 (2014).
  15. Chen, H., Ahmad, M., Rim, Y., Lucas, W. J., Kim, J. Y. Evolutionary and molecular analysis of Dof transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking. New Phytol. 198, 1250-1260 (2013).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLOS Biol. 6, e7 (2008).
  17. Zavaliev, R., Dong, X., Epel, B. L. Glycosylphosphatidylinositol (GPI) modification serves as a primary plasmodesmal targeting signal. Plant Physiol. 172, 1061-1073 (2016).
  18. Sasaki, N., Park, J. W., Maule, A. J., Nelson, R. S. The cysteine-histidine-rich region of the movement protein of Cucumber mosaic virus contributes to plasmodesmal targeting, zinc binding and pathogenesis. Virology. 349, 396-408 (2006).
  19. Kaido, M., Funatsu, N., Tsuno, Y., Mise, K., Okuno, T. Viral cell-to-cell movement requires formation of cortical punctate structures containing Red clover necrotic mosaic virus movement protein. Virology. 413, 205-215 (2011).
  20. Creager, A. N. H., Scholthof, K. B. G., Citovsky, V., Scholthof, H. B. Tobacco mosaic virus: pioneering research for a century. Plant Cell. 11, 301-308 (1999).
  21. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell movement protein. mBio. 7, e02052-e02015 (2016).
  22. Ueki, S., Citovsky, V. To gate, or not to gate: regulatory mechanisms for intercellular protein transport and virus movement in plants. Mol. Plant. 4, 782-793 (2011).
  23. Simpson, C., Thomas, C. L., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. Plant Cell. 21, 581-594 (2009).
  24. Maule, A. J. Plasmodesmata: structure, function and biogenesis. Curr. Opin. Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  25. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  26. Tzfira, T., et al. pSAT vectors: a modular series of plasmids for fluorescent protein tagging and expression of multiple genes in plants. Plant Mol. Biol. 57, 503-516 (2005).
  27. Chakrabarty, R., et al. pSITE vectors for stable integration or transient expression of autofluorescent protein fusions in plants: probing Nicotiana benthamiana-virus interactions. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 740-750 (2007).
  28. Chung, S. M., Frankman, E. L., Tzfira, T. A versatile vector system for multiple gene expression in plants. Trends Plant Sci. 10, 357-361 (2005).
  29. Lee, L. Y., Gelvin, S. B. T-DNA binary vectors and systems. Plant Physiol. 146, 325-332 (2008).
  30. Goderis, I. J., et al. A set of modular plant transformation vectors allowing flexible insertion of up to six expression units. Plant Mol. Biol. 50, 17-27 (2002).
  31. Walhout, A. J., et al. GATEWAY recombinational cloning: application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  32. Tzfira, T., et al. Transgenic Populus: a step-by-step protocol for its Agrobacterium-mediated transformation. Plant Mol. Biol. Rep. 15 (3), 219-235 (1997).
  33. Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 42 (3D), 1-7 (2016).
  34. Kapila, J., De Rycke, R., Van Montagu, M., Angenon, G. An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves. Plant Sci. , 101-108 (1997).
  35. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).
  36. Boyko, V., Ferralli, J., Ashby, J., Schellenbaum, P., Heinlein, M. Function of microtubules in intercellular transport of plant virus RNA. Nat. Cell Biol. 2, 826-832 (2000).
  37. Heinlein, M., Epel, B. L., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Interaction of tobamovirus movement proteins with the plant cytoskeleton. Science. 270, 1983-1985 (1995).
  38. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Santa-Cruz, S., Padgett, H. S., Beachy, R. N. Gating of epidermal plasmodesmata is restricted to the leading edge of expanding infection sites of tobacco mosaic virus (TMV). Plant J. 12, 781-789 (1997).
  39. Crawford, K. M., Zambryski, P. C. Non-targeted and targeted protein movement through plasmodesmata in leaves in different developmental and physiological states. Plant Physiol. 125, 1802-1812 (2001).
  40. Kotlizky, G., et al. A dysfunctional movement protein of Tobacco mosaic virus interferes with targeting of wild-type movement protein to microtubules. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 895-904 (2001).
  41. Ueki, S., Lacroix, B., Krichevsky, A., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Functional transient genetic transformation of Arabidopsis leaves by biolistic bombardment. Nat. Protoc. 4, 71-77 (2009).
  42. Giesman-Cookmeyer, D., Lommel, S. A. Alanine scanning mutagenesis of a plant virus movement protein identifies three functional domains. Plant Cell. 5, 973-982 (1993).
  43. Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1987).
  44. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of non-destructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit. Rev. Plant Sci. 23, 195-250 (2004).
  45. Lee, M. W., Yang, Y. Transient expression assay by agroinfiltration of leaves. Methods Mol. Biol. 323, 225-229 (2006).
  46. Burch-Smith, T. M., Schiff, M., Liu, Y., Dinesh-Kumar, S. P. Efficient virus-induced gene silencing in Arabidopsis. Plant Physiol. 142, 21-27 (2006).
  47. Tian, G. W., et al. High-throughput fluorescent tagging of full-length Arabidopsis gene products in planta. Plant Physiol. 135, 25-38 (2004).
  48. Tian, G. W., Chen, M. H., Zaltsman, A., Citovsky, V. A pollen-specific pectin methylesterase involved in pollen tube growth. Dev. Biol. 294, 83-91 (2006).
  49. Hunter, C. C., et al. Multiple nuclear localization signals mediate nuclear localization of the GATA transcription factor AreA. Eukaryot. Cell. 13, 527-538 (2014).

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Citar este artigo
Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta. J. Vis. Exp. (126), e55301, doi:10.3791/55301 (2017).
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