Сотовый Lineage Анализы и функции генов исследований с использованием Twin-спот MARCM

Мозг, состоящий из огромного количества разнообразных и типов нейронов, жертвует животных со способностью воспринимать, обрабатывать и реагировать на вызовы от внешнего мира. Нейроны взрослого Drosophila центрального мозга получают из ограниченного количества нервных стволовых клеток, называемых нейробласты (NBS), в течение развития ^{1, 2.} Большинство НБС участвующих в нейрогенез головного мозга у дрозофилы проходят асимметричное деление для генерации самообновляющихся NBS и ганглий материнские клетки (GMCS), и GMCs затем пройти через еще один раунд разделения , чтобы произвести две дочерние клетки , которые дифференцируются в нейроны ³ (рис 1А ). Из-за запутанности нейронного морфологии и проблемы, связанные с определением конкретных нейронов, положительно мозаичную технологии маркировки, мозаика анализ с репрессируемый клеток маркером (MARCM), был изобретен для того, чтобы visualizatион одного нейрона или небольшой группы нейронов из популяции окружающих, немеченых нейронов ^4.

MARCM использует флиппазы (FLP) / ФЛП целевой системы распознавания (FRT) посредничать сайт-специфической рекомбинации между гомологичными хромосомами внутри клетки – предшественника разделяющая несущего гетерозиготную аллель гена репрессора, экспрессия которого обычно ингибирует экспрессию гена – репортера ^4. После того, как митотического деления, рекомбинантные хромосомы разделены на близнецов клетки, таким образом, что одна клетка содержит гомозиготные аллели гена репрессора и другая ячейка не имеет репрессор гена-экспрессию репортера в этой ячейке (и его потомков) больше не является ⁴ заблокирован. Три клоновых узоры обычно встречаются в MARCM эксперименте, когда ФЛП стохастически индуцируется в NBS или ГМО: одноклеточные и двухкамерные-GMC клоны, которые изображают нейронную морфологию в одноклеточных Resolutioп, и многоклеточные-NB клонов, раскрывающие целые морфологические закономерности нейронов , происходящих от общего NB (рис. 1В) Методика MARCM широко применяется в Drosophila нейробиологических исследований, в том числе в идентификации нейронов типа для реконструкции мозга по всей проводки сетей, нейронная линия анализа для раскрытия истории развития нейронов, фенотипической характеризации генов функций , участвующих в спецификации клеточных судеб, и нейронный морфогенез и дифференциация изучает ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Поскольку обычные MARCM только этикетки одну из двух дочерних клеток (и родословных) после индуцированного события митотической рекомбинации, потенциально полезной информации от немаркированной стороны теряется. Это ограничение исключает применение основного МСистема ARCM с высокой разрешающей способностью анализа многих нейронных линий , которые переключают клеточные судьбы в быстром темпе или точности анализа функций генов в одинаковых нейронов различных животных ^{11, 12.}

Twin-спот MARCM (tsMARCM) представляет собой развитую систему , которая маркирует нейроны , полученные от общего предка с двумя различными цветами, что делает возможным восстановление полезной информации с обеих сторон близнецов клеток, таким образом преодолевая ограничения исходной системы MARCM ¹¹ ( Фигура 2А – 2С). В системе tsMARCM, две РНК – интерференция (RNAi) основе супрессоры расположены в транс-сайтов гомологичных хромосом в клетке – предшественника, и экспрессию этих супрессоров независимо друг от друга ингибируют экспрессию соответствующих репортеров (Фигура 2В). После сайт-специфической рекомбинации митотического опосредованное через систему FLP / FRT, то ТВто RNAi основе супрессоры стали разделены на две односпальные клетки , чтобы разрешить экспрессию различных репортеров (рис 2В). Два клоновых модели, одноклеточные , связанные с одноклеточных клонах и двуклеточной-GMC , связанных с многоклеточным-NB клонов, как правило , рассматривается в эксперименте tsMARCM (рис 2C). Информация, полученная от одной стороны сдвоенных ячеек могут быть использованы в качестве ссылки на другую сторону, что позволяет с высокой разрешающей способностью анализов нейронального происхождения, такие как рождение датирующим меченых нейронов, и фенотипический анализ идентичных нейронов у различных животных для точного расследования нейронной функции гена ^{11, 12.} Здесь мы приводим протокол шаг за шагом , описывающий , как провести эксперимент tsMARCM, который может быть использован в других лабораториях , чтобы расширить свои исследования развития нервной системы (а также развитие других тканей, если это применимо) у дрозофилы.