ツインスポットMARCMを使用して細胞系譜の解析と遺伝子機能研究

ニューロンの膨大な数と多様な種類からなる脳は、プロセスを知覚し、外界からのチャレンジに応答する能力を有する動物を付与します。成体ショウジョウバエ中央脳のニューロンは開発^1,2中、神経芽細胞（NBS）と呼ばれる神経幹細胞の限られた数から導出されます。 ショウジョウバエでは、脳の神経新生に関与するのNBのほとんどは、（ニューロン³に分化する2つの娘細胞を生成するために部門の別のラウンドを通過した後、自己再生のNBと神経節母細胞（GMCS）、およびGMCSを生成するために、非対称分裂を起こし、図1A ）。そのため神経形態の複雑さや特定のニューロンを識別するに伴う課題の、正のモザイクラベリング技術、抑制性細胞マーカー（MARCM）とのモザイク解析は、visualizatを有効にするために発明されました単一ニューロンまたは周囲の、非標識ニューロン⁴の人口のうち、ニューロンの小さなサブセットのイオン。

MARCMはフリッパーゼ（FLP）の発現通常レポーター遺伝子⁴の発現を阻害するリプレッサー遺伝子のヘテロ接合性対立遺伝子を保有する分割前駆細胞内で相同染色体間の部位特異的組換えを媒介する/ FLP認識標的（FRT）システムを利用します。有糸分裂後、組換え染色体が1つのセルはリプレッサー遺伝子のホモ接合対立遺伝子を含まず、他のセルは全く抑制遺伝子-そのセル内のレポーターの発現（とその子孫）はもはやいないように、ツインセルに分離されています^4を遮断^しました 。三つのクローンのパターンFLPが確率的のNBまたはGMCSに誘導されるとき、通常MARCM実験で発見さ：単細胞resolutioで神経形態を示している単一セルおよび2セル-GMCクローン、nと、共通のNB（ 図1B）由来のニューロンの全体の形態学的なパターンを明らかに多細胞-NBクローン、。 MARCM技術が広く脳全体の配線ネットワークを再構成するための神経細胞タイプ識別を含め、 ショウジョウバエ神経生物学の研究に適用されている、神経系統は、ニューロン、細胞運命の仕様に関与する遺伝子の機能の表現型の特徴の発達史を開示するための分析、および神経細胞の形態形成分化研究^{5、6、7、8、9、10。}従来MARCMのみ誘発される有糸分裂組換え事象の後に2つの娘細胞（および系統）のいずれかをラベルするので、マークされていない側からの潜在的に有用な情報が失われます。この制限は、基本的なMの適用を排除します高解像度にARCMシステムは、高速テンポで細胞の運命を切り替える多くの神経系統の解析や精度に異なる動物^11、12の同一の神経細胞に遺伝子機能の解析します。

ツインスポットMARCM（tsMARCM）が（そのため、元のMARCMシステム¹¹の限界を克服し、ツインセルの両側から有用な情報の回復を可能にする二つの異なる色で共通の前駆細胞に由来する神経細胞を標識する高度なシステムであり、 図2A – 2C）。 tsMARCMシステムでは、2つのRNA干渉（RNAi）は、抑制が前駆細胞中の相同染色体のトランスサイトに位置しているベース、及びそれらの抑制の発現は、独立して、それぞれのレポーター（ 図2B）の発現を阻害します。 FLP / FRT系を介して媒介部位特異的な有糸分裂組換えに続いて、TWなっOのRNAiベースの抑制は、異なるレポーター（ 図2B）の発現を可能にするために、ツインセルに分離しました。二つのクローンのパターンは、多細胞-NBクローンに関連付けられた単一細胞クローン及び2セル-GMCに関連付けられた単一細胞は、典型的にtsMARCM実験（ 図2C）に見られます。情報は、出生付き合っラベルされたニューロンなどの神経系統解析高解像度を可能にする、他の側面のための基準として利用することができるツインセルの一方の側に由来し、そして表現型は、正確な調査のために別の動物で同じニューロンの解析します神経遺伝子機能^11、12。ここで、我々は（該当する場合だけでなく、他の組織の開発）、ショウジョウバエにおける神経発達の学業を広げるために、他の研究室で使用することができますtsMARCM実験を、実施方法を説明したステップバイステップのプロトコルを提示します。