Cell Lineage Analyses en Gene Function studies met Twin-spot MARCM

De hersenen, bestaande uit een groot aantal en verschillende soorten neuronen, begiftigt dieren de mogelijkheid om waar te nemen, te verwerken en te reageren op de uitdagingen van de buitenwereld. Neuronen van de volwassen Drosophila centrale hersenen zijn afgeleid van een beperkt aantal neurale stamcellen, genaamd neuroblasts (AI), tijdens de ontwikkeling ^{1, 2.} Het grootste deel van de AI's die deelnemen aan de hersenen neurogenese in Drosophila ondergaan asymmetrische divisie zelf-vernieuwing NBs en ganglion moeder cellen (GMC's) te genereren, en de GMC ga dan via een andere ronde van de divisie twee dochter cellen die differentiëren tot neuronen ³ te produceren (Figuur 1A ). Vanwege de complexiteit van neuronale morfologie en de uitdagingen in verband met het identificeren van specifieke neuronen, een positieve mozaïek labeling technologie, mozaïek analyse met een onderdrukbare cel marker (MARCM), werd uitgevonden om het mogelijk te maken visualization van een enkel neuron of een klein deel van neuronen uit van de bevolking van de omgeving, niet-gemerkte neuronen ^4.

MARCM gebruikt de flippase (FLP) / FLP beeldherkenning (FRT) systeem plaatsspecifieke recombinatie tussen homologe chromosomen bemiddelen bij een scheidslijn voorlopercel die een heterozygote allel van een repressor gen, waarvan de expressie normaal remt de expressie van een reportergen ^4. Na de mitotische deling, worden de recombinante chromosomen gescheiden in twee cellen, zodanig dat één cel homozygote allelen van het repressor-gen en de andere cel geen repressor gen de expressie van het in die cel (en de nakomelingen) niet langer ⁴ geblokkeerd. Drie klonen patronen zijn meestal te vinden in een MARCM experiment wanneer FLP stochastisch wordt geïnduceerd in NBs of GMC's: single-cell en twee-cell-GMC-klonen, die neuronale morfologie bij single-cell resolutio verbeeldenn en meercellige NB-klonen, die volledige morfologische patronen van neuronen afgeleid van een gemeenschappelijke NB (Figuur 1B) tonen. De MARCM techniek is op grote schaal toegepast in Drosophila neurobiologische studies, waaronder in neuronale typeaanduiding voor het reconstrueren van brain-breed bedrading netwerken, neurale afkomst analyses voor de openbaarmaking van de ontwikkelingsgeschiedenis van neuronen, fenotypische karakterisatie van genfuncties betrokken bij het lot van de cel specificatie en neuronale morfogenese en differentiatie studies ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Omdat conventionele MARCM alleen etiketten één van de twee dochtercellen (en lijnen) na de geïnduceerde mitotische recombinatie evenement wordt mogelijk nuttige informatie uit de vrijstaande kant verloren. Deze beperking verzet tegen de toepassing van de fundamentele MARCM systeem om hoge-resolutie analyse van de vele neurale geslachten die cel lot te schakelen in snel tempo of precisie analyses van gen functies in dezelfde neuronen van verschillende dieren ^{11, 12.}

Twin-spot MARCM (tsMARCM) is een geavanceerd systeem dat neuronen afkomstig uit een gemeenschappelijke voorouder met twee verschillende kleuren etiketten, waarbij de terugwinning van nuttige informatie uit beide zijden van de twee cellen mogelijk maakt, waardoor de beperking van het oorspronkelijke MARCM systeem ¹¹ (overwinnen Figuur 2A – 2C). In het tsMARCM systeem, twee RNA interferentie (RNAi) gebaseerde dempers liggen op trans-plaatsen van homologe chromosomen in een voorlopercel en de expressie van de suppressors de expressie van hun respectieve reporters (figuur 2B) onafhankelijk remmen. Naar aanleiding van site-specific mitotische recombinatie gemedieerd door de FLP / FRT-systeem, de two RNAi-gebaseerde suppressors worden gescheiden in twee cellen om de expressie van verschillende reporters (figuur 2B) toe. Twee klonale patronen, eencellige geassocieerd met eencellige klonen en twee cel-GMC geassocieerd met meercellige NB-klonen, worden typisch gezien in een tsMARCM experiment (figuur 2C). Informatie afkomstig van de ene kant van de twee cellen kan worden gebruikt als referentie voor de andere zijde, waardoor een hoge-resolutie neurale stam analyses, zoals geboorte uit het gemerkte neuronen en fenotypische analyses van dezelfde neuronen verschillende dieren nauwkeurig onderzoek van neurale genfunctie ^{11, 12.} Hier presenteren we een stap-voor-stap protocol beschrijft hoe een tsMARCM experiment, dat door andere laboratoria kunnen worden gebruikt om hun onderzoek van neurale ontwikkeling verbreden voeren (alsook de ontwikkeling van andere weefsels, indien van toepassing) in Drosophila.