In vitro-differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till trophoblastic celler

Moderkakan krävs för tillväxt och överlevnad av fostret under graviditeten och underlättar utbytet av gaser, näringsämnen, avfallsprodukter och hormoner mellan moderns och fostrets cirkulation. Det första organet bildas under däggdjursembryogenes är moderkakan, som börjar att utveckla 6-7 dagar efter befruktning hos människor och 3,5-4,5 dagar hos möss ^{1, 2, 3, 4.} Trofoblastiska celler är de viktigaste cellerna i moderkakan, och dessa celler representerar en av de tidigaste härstamning differentiering händelserna i däggdjursembryo. De uppstår från de yttre extra embryonala trophectoderm celler i preimplantatorisk blastocyst. Vår kunskap om de tidiga stadierna av placenta utveckling begränsas av etiska och logistiska begränsningar för modellering människans tidiga utveckling.

Under embryonala implantation, trofoblasterinvadera moderns epitel och differentierar till specialiserade progenitorceller ^5. Cytotrofoblaster (CTBs) är mononukleära, odifferentierade stamceller som smälter och differentieras till syncytiotrophoblasts (Syns) och extravillous invasiva trofoblaster (EVTs), vilket ankare moderkakan i livmodern. Syns är flerkärniga, terminalt differentierade celler som syntetiserar hormoner som är nödvändiga för att upprätthålla graviditet. De tidiga differentieringshändelser som genererar EVTs och Syns är avgörande för placenta bildning, som försämringar i trofoblastiska celler resulterar i missfall, havandeskapsförgiftning, och intrauterin tillväxthämning ^1. De typer av trofoblasten cellinjer mänskliga som har utvecklats innefattar odödlig CTBs och choriocarcinomas, som producerar moderkakan hormoner och visa invasiva egenskaper ^6. Primära trofoblastiska celler från humana första trimestern placentor kan isoleras, men cellerna snabbt differentiate och stoppa prolifererande in vitro. Viktigt är transformerade och primära cellinjer har olika genuttrycksprofilerna, vilket tyder på att tumörogena och förevigade trofoblasten cellinjer inte exakt kan representera primär trofoblaster ^7. Dessutom är det osannolikt att likna placental trofoblasten stamceller stamceller eftersom de härrör från senare steg först genom tredje trimestern dessa linjer.

Det finns ett behov av en robust in vitro-kultur system för tidigt skede mänskliga trofoblaster för att studera de tidiga händelserna i placenta bildning och funktion. Humana embryonala stamceller (hESCs), som delar egenskaper med den inre cellmassan av preimplantationsembryot, används ofta för att modellera människans tidiga utveckling, inklusive bildandet av den tidiga moderkakan. Både mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och hESCs kan delas in i trofoblaster in vitro med hjälp av Bone Morphogenic protein 4 (BMP4) ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.} Denna omvandling av pluripotenta celler till trofoblastiska celler med användning av BMP4 är specifik för humana celler och används ofta för att studera utvecklingen av den tidiga human placenta, eftersom den inte kräver tillgång till tidiga mänskliga embryon ^{9, 16.} Nyligen upptäcktes det att tillsatsen av inhibitorerna A83-01 (A) och PD173074 (P), som blockerar de Smad2 / 3 och MEK1 / 2 signalvägar, ökar effektiviteten i hPSC differentiering till trophectoderm liknande progenitorer, huvudsakligen Syns och EVTs, utan omfattande generationen av mesoderm, endoderm, eller ektoderm celler ^{9, 17} </sup>. Med hjälp av dessa mediumförhållanden, hESCs differentieras för 12 dagar har liknande genuttrycksprofilerna som trophectoderm celler som isolerats från blastocyst skede embryon mänskliga och utsöndrar olika placenta specifik tillväxthormoner, stödja giltigheten av detta in vitro-modellsystem ^{9, 11.} Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för differentiering in vitro av hPSCs i humana trofoblasten stamceller med hjälp av BMP4 / A / P odlingsmedium. Dessa villkor producerar rikliga mängder celler för en mängd olika tillämpningar, inklusive RNA-sekvensering, gen störningar med hjälp av siRNA, patogena infektioner, och genetisk modifiering med hjälp av lipofektion-medierad transfektion.