целевое<em> В Ситу</em> мутагенеза гистона Гены в почкующихся дрожжах

Четыре основных белков гистонов H2A, H2B, H3, H4 и играют центральную роль в уплотнению, организации и функции эукариотических хромосом. Два комплекта каждого из этих гистонов образуют гистонов октамером, молекулярный катушку , которая направляет оборачивание ~ 147 пар оснований ДНК вокруг себя, в конечном счете , приводит к образованию нуклеосом ^1. Нуклеосомы являются активными участниками различных процессов хромосом на основе, например, регуляции транскрипции генов и формирования эухроматином и гетерохроматина через хромосом, и как таковые были в центре внимания интенсивных исследований в течение последних нескольких десятилетий. Ряд механизмов, были описаны, с помощью которых нуклеосомы можно манипулировать такими способами, которые могут облегчить выполнение определенных процессов – эти механизмы включают в посттрансляционной модификации гистонов остатков, АТФ-зависимой нуклеосом ремоделирование и АТФ-независимую реорганизацию нуклеосоми монтаж / демонтаж ^{2, 3.}

Многообещающий дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE является особенно мощным модельным организмом для понимания функции гистонов в эукариот. Это может быть в значительной степени связано с высокой степенью эволюционного сохранения гистоновых белков во всей области Eukarya и аменабельности дрожжей до разнообразных генетических и биохимических экспериментальных подходов ^4. Реверс-генетические подходы у дрожжей широко используется для изучения влияния специфических мутаций гистонов по различным аспектам биологии хроматина. Для этих типов экспериментов часто предпочтительно использовать клетки, в которых мутантный гистоны, экспрессируемые из их родного геномного локуса, как экспрессия из автономных плазмид может привести к ненормальной внутриклеточных уровней белков гистонов (из-за разного количества плазмид в клетках) и сопутствующее изменение хроматина анvironments, которые могут в конечном счете, запутать интерпретацию результатов.

Здесь мы опишем метод ПЦР на основе, которая позволяет направленного мутагенеза генов гистонов на их родных геномных местах, которые не требуют стадии клонирования и приводит к генерации желаемой мутации (ов) без оставшихся последовательностей экзогенной ДНК в геноме. Этот метод использует преимущества эффективной системы гомологичной рекомбинации у дрожжей и имеет ряд общих черт с другими подобными методами , разработанными другими группами – в первую очередь на Delitto Perfetto, сайт-специфической геномной (SSG) мутагенеза и клонированию свободной ПЦР на основе аллель методы замены ^{5, 6, 7.} Тем не менее, этот метод описан имеет аспект, который делает его особенно хорошо подходит для мутагенеза генов гистонов. В гаплоидных клетках дрожжей, каждый из четырех основных гистонов кодируется двумя не-Аllelic и высоко гомологичных генов: например, гистона Н3 , кодируемые генами HHT1 и HHT2, и открытые рамки считывания (ORFs) двух генов более 90% идентична последовательности в определенной последовательности. Такая высокая степень гомологии может осложнить эксперименты, направленные на специально направлены одной из двух гистонов генов, кодирующих для мутагенеза. Принимая во внимание вышеупомянутые методы часто требуют использования, по крайней мере некоторых последовательностей в пределах ORF гена-мишени для привода гомологичной рекомбинации, методика описана здесь использует последовательности, фланкирующие ORFs генов гистонов (в которых намного меньше гомологии последовательностей) для стадия рекомбинации, таким образом, увеличивая вероятность успешного нацеливания мутагенеза до нужного локуса. Кроме того, гомологичные регионы, что диск рекомбинации может быть очень обширным, дополнительно способствуя эффективной целевой гомологичной рекомбинации.