Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Ibrahim B. Durowoju; Kamaljit S. Bhandal; Jian Hu; Bruce Carpick; Marina Kirkitadze

doi:10.3791/55262

JoVE Journal > Biochemistry

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Bioquímica

Calorimetria a scansione differenziale - Un metodo per la valutazione della stabilità termica e la conformazione della proteina dell'antigene

Published: March 04, 2017

doi:

10.3791/55262

Ibrahim B. Durowoju¹, Kamaljit S. Bhandal¹, Jian Hu¹, Bruce Carpick¹, Marina Kirkitadze¹

¹Analytical Research & Development,Sanofi Pasteur Limited

Summary

Calorimetria differenziale a scansione misura la temperatura di transizione termica (s) ed energia termica totale richiesta per denaturare una proteina. I risultati ottenuti sono utilizzati per valutare la stabilità termica di antigeni proteici in formulazioni di vaccino.

Abstract

Calorimetria differenziale a scansione (DSC) è una tecnica analitica che misura la capacità termica molare di campioni in funzione della temperatura. Nel caso di campioni di proteine, profili DSC forniscono informazioni sulla stabilità termica, e in qualche misura serve come "impronta digitale" strutturale che può essere utilizzato per valutare la conformazione strutturale. Viene eseguita utilizzando un calorimetro a scansione differenziale che misura la temperatura di transizione termica (temperatura di fusione; T _m) e l'energia necessaria per interrompere le interazioni stabilizzazione della struttura terziaria (entalpia; d H) delle proteine. I confronti sono fatti tra formulazioni e lotti di produzione, e le differenze di valori derivati indicano differenze di stabilità termica e la conformazione strutturale. I dati che illustrano l'uso della DSC in un ambiente industriale per gli studi di stabilità così come il monitoraggio fasi di produzione principali sono forniti come prova dell'efficacia di questo proprotocollo. In confronto ad altri metodi di valutazione della stabilità termica di conformazioni proteiche, DSC è conveniente, richiede poche fasi di preparazione del campione, e fornisce anche un profilo termodinamico completo del processo dispiegarsi proteine.

Introduction

Calorimetria differenziale a scansione (DSC) è un metodo sperimentale che misura direttamente la differenza di calore assorbimento di energia che avviene in un campione rispetto ad un riferimento durante un cambiamento regolamentato temperature ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ^{^8,} ⁹ ^, ^{^10,} ^{^11,} ^12. Effettuato in un calorimetro a scansione differenziale, il metodo implica l'introduzione di energia termica in una cella campione e una cella di riferimento contemporaneamente mentre identicamente aumentando la temperatura di entrambe le celle nel tempo ^{^2,} ^{^13,}14. Grazie alla differenza nella composizione del campione e il riferimento, sarà richiesto diversa quantità di energia per aumentare la temperatura delle celle ^{^2,} ^{^12,} ^13. Così, la quantità in eccesso di energia necessaria per compensare la differenza di temperatura tra le cellule viene misurata e direttamente correlata a specifiche proprietà termodinamiche del campione ^{^1,} ^3.

Nel 1960, MJ O'Neil e E. Watson di Perkin Elmer sviluppato il primo calorimetro a scansione differenziale per misurare il flusso di calore di materiali solidi ^{^2,} ^{^3,} ^4. In parallelo, PL Privalov e DR Monaseldze EL dell'Istituto di Fisica, Repubblica di Georgia (ex URSS) hanno creato un calorimetro adiabatico differenziale unico che può essere utilizzato foR ricerca biochimica ^{^5,} ^6. Successivamente, la squadra di Andronikashvili presso l'Istituto di Fisica, Repubblica di Georgia, ha riferito la capacità termica di biomolecole quali proteine fibrose e globulari, DNA e RNA utilizzando DSC ^{^7,} ^{^8,} ^9. Diverse squadre guidate da Sturtevant ^{^10,} ^{^11,} ^12, ¹³ Brandts e Privalov ^{^14,} ^{^15,} ¹⁶ focalizzati sullo sviluppo della teoria e applicazioni pratiche di DSC per indagare i dettagli termodinamici di proteine svolgimento. Il valore della DSC a studiare grandi strutture supramolecolari quali fagi, cloroplasto, cristalli liquidi fosfolipidi e proteine della carne sono stati riportati anche ¹⁷ </ ^sup>, ^{^18,} ^{^19,} ^20.

DSC è diventato comune in ricerca e sviluppo farmaceutico per la valutazione della stabilità termica di biomolecole, specialmente proteine ^{^1,} ^{^21,} ^22. Ciò è dovuto principalmente ai progressi in termini di sensibilità e automazione della strumentazione utilizzata per condurre l'esperimento ^{^23,} ^24. Qui, il risultato finale dell'esperimento DSC, cioè capacità termica molare in funzione della temperatura, è usata per stimare i seguenti parametri termodinamici (variazione capacità termica (ΔCp), entalpia (d H), entropia (ΔS) e energia libera di Gibbs (DeltaG)) utilizzando la seguente equazione:

eq1.jpg "/> (1)

(2)

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(4)

(5)

Dove Cp si misura la capacità termica; q è il flusso di calore nel materiale da testare; T ₀ e T sono le temperature iniziale e finale della transizione, rispettivamente ^{^22,} ^25. E 'anche interessante notare che le equazioni di cui sopra si applicano alle proteine singolo dominio che possono subire transizione di due stati e reversibile termico dispiegarsi ^22. L'analisi delle proteine più complesse (ad esempio proteine, non-due stati, e oligomeri) have stata riportata da Friere et al. ^26; Johnson et al. ^27; e Kasimova et al. ^28.

Per determinare se una proteina subisce transizione di due stati o forme intermedie durante denaturazione termica, l'entalpia sperimentale derivato (d H, indicato anche come calorimetrica entalpia d H _Cal) viene confrontato con il entalpia derivato utilizzando l'equazione di van't Hoff indicato di seguito (anche denominato van't Hoff entalpia; d H _VH):

(6)

Dove T _m è la temperatura punto medio della transizione, R è la costante dei gas ideali (1.987 cal mol ^-1 K ^-1) e Y è la frazione della popolazione proteine a foglio spiegato ^{^16,} ^29. SeD H _VH è pari a d H _Cal; o d H _VH / d H _Cal è uguale a 1, quindi la proteina subisce una transizione "tutto o niente" (cioè transizione due stati) ^{^16,} ^{^25,} ^29. Tuttavia, se d H _VH è inferiore a d H _Cal; o d H _VH / d H _Cal è inferiore a 1, la proteina subisce una transizione non due stati ^{^16,} ^{^25,} ^29. Il rapporto d H _VH / d H _Cal corrisponde anche alla proporzione della struttura delle proteine che si scioglie come unità cooperativa termodinamico o dominio ^26.

I parametri termodinamici di cui sopra, come DeltaG e d H forniscono informazioni utili sulla stabilità termica delle proteine, tra cui farmaci biologici ^30. Tuttavia, l'accento sarà posto sulla T _m e d H in questa pubblicazione, in quanto sono i valori riportati per questo protocollo. T _m è la temperatura punto medio della transizione, dove la piegati e gli stati unfolded della proteina sono all'equilibrio (cioè, DeltaG = 0) ^{^25,} ^31. Maggiore è la T _m di una proteina, maggiore è la sua stabilità termica ^31. D H corrisponde l'area sotto il picco (s) della capacità termica contro grafico di temperatura (noto anche come termogramma) generato alla fine dell'esperimento DSC ^{^16,} ^25. È l'energia necessaria per denaturare le proteine e può essere utilizzato per stimare la frazione attiva (F _a) in una formulazione proteine (cioè, la proporzione di proteine con conformazione attiva in un campione) utilizzando la seguente equazione:

jove_content ">

(7)

Dove d H è l'entalpia sperimentalmente derivati del campione di proteine e Q è l'entalpia determinato per un riferimento ben caratterizzato o proteine standardizzato ^22. La stima di F _a è importante per monitorare la stabilità in tempo reale dei prodotti, nonché la realizzazione di studi di stabilità in condizioni di stress, come richiesto dalle linee guida ICH ^32. Confronto di d H fornisce anche informazioni circa la compattezza della struttura conformazione terziaria di una proteina ^31.

Dettagli Questo protocollo una procedura per valutare la stabilità termica delle proteine in un ambiente industriale ed è stato ampiamente utilizzato per la formulazione di vaccini. È stato sviluppato utilizzando un calorimetro a scansione differenziale automatizzato che genera risultati riproducibili fo concentrazioni di proteine a partire da 300 mg / mL.

Protocol

1. Strumento di avvio Accendere il calorimetro a scansione differenziale ed aumentare la pressione nelle celle per sopprimere ebollizione dei campioni e prevenire la formazione delle bolle a temperature elevate. Questo è tipicamente ottenuto alimentando azoto nel sistema. A seconda del materiale costituente della cellula (ad esempio, tantalio, oro, platino, ecc), regolare la pressione del gas di alimentazione dell'azoto secondo pressione raccomandata dal produttore per evitare di danneggiare la cella. Ad esempio, impostare la pressione di alimentazione del gas di azoto a 45 psi per lo strumento utilizzato per sviluppare questo procedimento, e la pressione superiore a 80 psi può danneggiare la cella. Assicurarsi che tutti i serbatoi degli agenti di pulizia sono riempiti al volume desiderato. I detergenti richiesti includono acqua e detergente per lavare e pulire la cella, rispettivamente, dopo ogni esecuzione del campione. Impostare la temperatura del vano campione tienead un valore adeguato, preferibilmente 5 ° C, per mantenere l'integrità del campione prima di sperimentare. Preparazione 2. campione Dializzare campione contro il buffer che verrà utilizzato come riferimento per l'esperimento. In alternativa, tampone di eluizione raccolti nella fase finale di purificazione della proteina (cioè eluizione colonna) può essere utilizzato. Determinare la concentrazione del campione proteico utilizzando il più adatto metodo di determinazione della concentrazione di proteine, come metodo al Kjealdahl 33 o il metodo Lowry 34. Per confronto oggettivo dei risultati, utilizzare lo stesso metodo in modo coerente all'interno dello stesso studio. L'intervallo di concentrazione richiesto può variare a seconda del modello di strumento. Per lo strumento utilizzato in questo protocollo, il campo di lavoro preferibile è 0,5-1 mg / mL. Degas il buffer di campione e di riferimento nel vuoto per sbarazzarsi di microbolle che possono causare il volume inaccurACY. Questo passaggio può essere saltato per i modelli più recenti calorimetro. Usando una micropipetta e punte sterili in un armadio biocontenimento flusso laminare, caricare i campioni e il loro rispettivo tampone a coppie in piastre da 96 pozzetti compatibili con lo strumento. Riempire le prime due coppie di pozzetti con tampone e le ultime due coppie con acqua per il buffer-buffer e la scansione dell'acqua, rispettivamente. Scansioni Buffer-tampone verificare l'idoneità dello strumento prima di assaggiare la misura (vale a dire la valutazione dell'errore strumentazione), così come stabilire una linea di base; mentre scansioni acqua vengono eseguiti per pulire le cellule. Coprire la piastra a 96 pozzetti con un film di sigillatura, e garantire che i pozzi siano adeguatamente sigillati prima di prendere il piatto fuori dalla biosicurezza gabinetto per evitare la contaminazione del campione. Porre la piastra in vano campione tenendo nel giusto orientamento. Setup 3. Sperimentale Parametro Nota: A seconda della instrumentation, i campioni possono essere caricati nella cellula sia manualmente con una siringa, o automaticamente utilizzando un autocampionatore. In questo caso (cioè un ambiente industriale), un autocampionatore viene utilizzato per risparmiare tempo. Utilizzando il software di acquisizione, inserire le informazioni del campione nell'ordine della piastra è stato caricato di cui al punto 2.4. Inserisci concentrazioni se disponibile, altrimenti immettere valori di concentrazione in software di analisi prima analisi dei dati (paragrafo 4.2). Selezionare l'opzione che assicura la pulizia delle cellule con detersivo prima ogni scansione del campione, che dovrebbe essere seguito da più passaggi dell'acqua di risciacquo per assicurare residui di detersivo residua delle cellule. Impostare la temperatura iniziale dell'esperimento a 20 ° C, ma questo può variare a seconda previa conoscenza del campione. Per proteine note, predeterminata temperatura di partenza può essere usato, mentre una temperatura iniziale inferiore può essere utilizzata anche per campioni sconosciuti. Impostare la temperatura finaledell'esperimento, ad esempio 100 ° C. La temperatura finale può variare a seconda previa conoscenza del campione. Impostare la frequenza di scansione dell'esperimento, ad esempio 60 ° C / h, che è la velocità di scansione tipica. Tuttavia, velocità di scansione può variare a seconda previa conoscenza del campione, ad esempio 90 ° C / h, o 120 ° C / h. È consigliabile eseguire la scansione di campioni sconosciuti a velocità di scansione differenti per valutare la cinetica di svolgimento. campioni Rescan per indagare la reversibilità del dispiegarsi termica. Il dispiegamento di una proteina è considerata reversibili se l'entalpia ottenuto per la seconda scansione è almeno 80% del valore entalpia per la prima scansione. Impostare il termostato post-esperimento a 10 ° C per preservare l'integrità delle cellule del calorimetro. Verificare che i parametri di configurazione dell'esperimento siano corretti prima di eseguire l'esperimento. Se tutto è a posto, avviare l'esperimento. 4. DatiANALISI Recupero dati grezzi dall'esperimento e selezionare un campione alla volta per l'analisi. Scansione Sottrazione di riferimento, cioè di buffer, dalla scansione del campione. NOTA: Riferimento sottrazione viene eseguita automaticamente da più recenti modelli di strumenti DSC. Inserire il valore di concentrazione del campione se è stato omesso di cui al punto 3.1. Montare e sottrarre linea di base dal termogramma acquisito per tenere conto di differenze nelle capacità termiche degli stati piegati e ripiegati della proteina che è causato dalla esposizione di gruppi idrofobici all'acqua su di dispiegarsi. Lineare o adattamento della curva cubica possono essere applicati a seconda della forma del profilo DSC per il campione. Per coerenza, lo stesso tipo di raccordo deve essere utilizzato durante uno studio, ad esempio studio di stabilità in tempo reale. Questo passo è necessario per elaborare la curva per l'integrazione dei picchi di ottenere entalpia di transizione. Eseguire l'integrazione di picco utilizzando non-lineare dei minimi quadrati. Sulla base del prodottoconoscenza applicare due stati o modello non-due stati. il modello a due stati può essere utilizzata per le singole transizioni termiche cooperative, e per le proteine sconosciute, applicare il modello non-due stati fino ad ulteriore conoscenza del prodotto è disponibile. Se del caso, regolare la curva di montaggio utilizzando la curva di funzione raccordo iterativa del software dell'apparecchiatura fino a quando il valore del chi-quadro rimane costante. I risultati ottenuti mostrano i valori per punto medio di temperature di transizione (TM), entalpia calorimetrica (d H), e Van't Hoff entalpia (d H VH) del campione.

Representative Results

I dati grezzi maggior parte degli esperimenti DSC sono presentati come un flusso di calore rispetto grafico delle temperature, come calorimetro misura effettivamente la differenza nel tasso di flusso di calore nella soluzione campione e tampone 35. Pertanto, se entrambe le celle (cioè le cellule del campione e di riferimento) contengono soluzioni identiche durante un esperimento, i dati grezzi dalla scansione dovrebbe essere una linea piatta, senza picchi osservabili. Ogni picco osservato può essere attribuito a un errore della strumentazione (ad esempio, danneggiati o contaminati celle), che è il motivo per cui in esecuzione delle scansioni del buffer prima campione di analisi è un test di sistema di idoneità adeguata. La Figura 1 illustra il risultato di una tipica scansione di buffer che indica che calorimetro era in buone condizioni prima campione di analisi. La Figura 2 mostra i dati grezzi per un esperimento DSC effettuata su difflotti diversi di due campioni di proteine. Come accennato più sopra, i picchi osservati sono le differenze nel flusso di calore dei campioni e dei rispettivi buffer. Le differenze di concentrazione del campione possono causare variazioni nella capacità termica registrata dal calorimetro; Tuttavia, queste variazioni sono normalizzati durante l'analisi del campione di cui al punto 4.2 della procedura. Concentrazioni più elevate possono anche rivelare i domini termodinamici aggiuntivi non contribuendo alla transizione a concentrazioni più basse. Inoltre, ogni transizione rappresenta un dominio termodinamico che può includere uno o più domini strutturali della proteina 36. In questo caso, la proteina 1 ha tre domini strutturali che si sciolgono in cooperazione. La Figura 3 mostra i risultati generati dall'analisi dei dati grezzi per proteina 1 e 2 presentati nella figura 2, cioè, dopo basale sottrazione e iterativo curva fitting. I termogrammi risultanti sono stati normalizzati per la scansione di frequenza (effettuata automaticamente da un algoritmo di pre-impostato nel software di analisi) e la concentrazione; in tal modo, presentando i risultati dell'esperimento di capacità termica paragonabile rispetto grafici della temperatura. Il software di analisi utilizza i dati dalla capacità termica rispetto grafici di temperatura, come T m e ΔCp, per derivare altri parametri termodinamici utilizzano varianti delle equazioni sopra riportate seconda della cooperatività di proteine svolgimento. Durante il test di campioni sconosciuti, impostare l'intervallo di temperatura appropriata è fondamentale. Altrimenti, termogrammi incompleti comportano, come illustrato nella figura 4. Anche se T m da tali profili può essere derivata, d H non può essere determinato con precisione. Pertanto, il campione deve essere riprovato con un intervallo di temperatura maggiore per catturare completamente i transizione termica. Alcune proteine anche rimodulo adily aggregati dopo la completa denaturazione, determinando una capacità termica post-transizione aumentando: questo spesso appare come un termogramma incompleta come illustrato in Figura 2B. Tuttavia, rianalisi con temperatura finale superiore può aiutare a confermare se vi sia un evento di una transizione conformazionale a quella regione del termogramma o è solo l'effetto di calore di assorbimento di aggregati proteici. La stabilità termica è uno dei più importanti proprietà fisiche delle proteine e dei prodotti a base di proteine del settore 37. In farmaceutico, è utilizzato per determinare la stabilità dei biologici in diverse condizioni, tra tamponi formulazione e fattori ambientali quali umidità e temperatura. E 'anche usato per monitorare chiave fase di produzione (ad esempio, purificazione e disintossicazione) per garantire la coerenza tra le conformazionale lotti di produzione. <strong > Figure 5 e 6 illustrano l'uso di DSC per esaminare gli effetti delle condizioni di disintossicazione e di stoccaggio chimici rispettivamente sulla stabilità e la conformazione strutturale delle due proteine differenti. Le differenze significative nel Tm e d H indicano cambiamenti conformazionali e degradazione delle proteine, rispettivamente. Inoltre, la perdita del terzo transizione nella figura 6 illustra ulteriormente la degradazione di un dominio che è stato confermato da una diminuzione del peso molecolare quando i campioni sono stati analizzati utilizzando cromatografia di esclusione molecolare con multi-angolo dispersione della luce (SEC-MALS) ( dati non mostrati). Figura 1: Buffer Scansioni. La somiglianza in gradiente di ogni scansione senza picchi osservabili indica che lo strumento è in buone condizioni e generato risultati riproducibili.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2: dati grezzi raccolti da esperimenti DSC. Questi grafici sono buone rappresentazioni dei dati non analizzati (RAW) acquisite dopo prove sperimentali (ad esempio prima di sottrazione della linea di base e curve fitting). Ogni linea rappresenta un lotto di produzione. Protein 2 tende ad aggregare più facilmente in seguito a riscaldamento, con un conseguente aumento della capacità termica superiore a 100 ° C nella regione post-transizione del termogramma. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <br/> Figura 3: Analyzed DSC dati. Questi grafici sono buone rappresentazioni di dati DSC analizzati (cioè dopo la sottrazione della linea di base e curve fitting). La linea blu rappresenta il termogramma dopo il basale sottrazione, mentre la linea rossa rappresenta la curva con il migliore adattamento al termogramma. (A) La T m e d H per Protein 1 Campione n ° 12 sono 80.16 ° C e 1,69 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. (B) La T m e d H per Protein 1 Esempio # 13 sono 80.15 ° C e 1,71 x 10 6 cal / mol rispettivamente. (C) La T m e d H per la Proteina 2 Esempio # 21 sono 75.01 ° C e 4,08 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. (D) La T m e d H per la Proteina 2 Esempio # 22 sono 75.67 ° C e 4,22 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. Clicca qui pervisualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Un Termogramma incompleto. I dati grezzi raccolgono per Protein 1 analizzato in un intervallo di temperatura inadeguata. La temperatura finale di esperimento è stato impostato a 90 ° C che non accogliere l'intero profilo di transizione della proteina rispetto al esperimento figura 2A che è stata impostata a 120 ° C. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5: hanno analizzato i dati che mostra l'effetto di disintossicazione chimica sulla struttura terziaria della Proteina 1. (A) Protein 1 è una tossina nella sua conformazione nativa e has la sua T m a 56.84 ° C e d H a 2,57 x 10 5 cal / mol. (B) La forma disintossicata di Protein 1 (cioè tossoide) ha T valori d H di 81.01 ° C m ed e 1,89 x 10 6 cal / mol, rispettivamente. Pertanto, si può concludere che la fase di disintossicazione introdotto qualche forma di variazione della conformazione strutturale della proteina 1, che conferisce maggiore stabilità (superiore T m) alla sua forma disintossicata. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 6: ha analizzato i dati che mostra l'effetto delle condizioni di magazzinaggio sulla conformazione delle proteine 3. Questi grafici illustrano l'effetto della temperatura di conservazione (2-8 ° C) sulla stabilità e la struttura terziaria della ProTEIN 3 più di 30 settimane. La T valori d H per Protein 3 a 8 ° (A) e 38 ° settimana (B) di stoccaggio m e sono riportati nella tabella 1 che segue. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Campione Tm 1 (° C) D H 1 (cal / mol) Tm 2 (° C) D H 2 (cal / mol) Tm 3 (° C) D H 3 (cal / mol) Protein 3 conservato a 2-8 ° C per 8 settimane 61.91 1.71 x 10 5 75.54 2.17 x 10 5 90.29 4.17 x 10 5 <td> Protein 3 conservato a 2-8 ° C per 38 settimane 61,87 1,66 x 10 5 75.18 1.46 x 10 5 90.22 5,76 x 10 5 Tabella 1: Tm e d H Valori per Protein 3 al 8 ° e 38 ° settimana di conservazione a 2 – 8 ° C. Sebbene i valori m T in entrambi i punti temporali sono simili, la differenza nei valori d H indica che la struttura terziaria della proteina 3 è degradato oltre 30 settimane sotto la condizione di memoria specificato.

Discussion

Questa procedura è stata incorporata con successo in vari pacchetti di test di caratterizzazione, tra stabilità e comparabilità dei prodotti studi ^21. In studi di stabilità in tempo reale, DSC viene utilizzato per monitorare la T _m, nonché stimare la F _a dei biologici nel tempo per determinare la shelf-life. Per quanto riguarda comparabilità del prodotto, che viene usato per valutare l'impatto del processo e cambiamento impianto così come l'effetto di fasi di produzione chiave sulla conformazione strutturale dei lotti prodotti. Ciò comporta in genere il confronto diretto del d H del lotto prodotto per un prodotto di riferimento che è stato designato come il prodotto ideale. Inoltre, DSC ha dimostrato di essere un utile strumento analitico per studi formulativi prodotto ^37. La T _m di una proteina in differenti tamponi ea differenti concentrazioni può essere utilizzato per determinare la formulazione che porge più stabilitàla proteina.

Per garantire l'affidabilità di questo metodo e l'obiettività dei suoi risultati, è importante mantenere i parametri di test coerente da corsa per eseguire all'interno dello stesso studio (per esempio, lo studio formulazione del vaccino). Tuttavia, la procedura può essere modificato per accogliere le differenze nelle proprietà fisiche delle varie proteine. Un esempio di una modifica che può essere fatto sta modificando la velocità di scansione dell'esperimento ^{^38,} ^39. Proteine che erano inclini a aggregati formano quando riscaldato sono stati esaminati ad una velocità di scansione più veloce (per esempio 120 ° C / h) per evitare il contributo degli aggregati al profilo transizione termica nonché intasamento dei capillari del calorimetro. Vale la pena notare che la scansione di tasso può influenzare il risultato di un esperimento DSC ^38. L'ampliamento del picco transizione termica è stato osservato con crescente velocità di scansione in qualche proproteine; tuttavia, T _m è rimasto abbastanza costante ^38. Inoltre, la procedura di dialisi e di degasaggio per la preparazione dei campioni sono anche molto importante per ottenere risultati accurati ^31. Dialisi assicura che l'unica differenza nella composizione del campione e il buffer è la proteina; pertanto, tutti gli eccessi di calore assorbito dal campione può essere attribuita alla capacità termica della proteina. Degasaggio assicura precisa analisi del volume, come l'estrapolazione del parametro termodinamico presuppone che l'evento si sta verificando svolgersi sotto costante volume e pressione ^31. La porzione di pressione costante del presupposto è rappresentato da azoto pressurizzazione del sistema di cui al punto 1.1 della procedura.

In confronto ad altri metodi per determinare la stabilità di conformazioni proteiche come dicroismo circolare (CD) e fluorescenza Spettroscopie, DSC offre una serie di vantaggi in un comimpostazione commerciale tra cui risparmio di costi e di tempo. In primo luogo, il disegno adiabatica di un calorimetro a scansione differenziale consente la misura della stabilità termica con una migliore precisione di temperatura rispetto a misure con strumentazione per CD e fluorescenza Spettroscopie ^6. In secondo luogo, a differenza CD, la precisione dei dati DSC non dipende dalla elicità della proteina ^{^39,} ^40; tuttavia, CD fornisce ulteriori informazioni sul dispiegarsi della struttura secondaria, che sarebbe gratuito per la DSC ^41. Inoltre, la pressurizzazione del sistema DSC consente la verifica con un ampio intervallo di temperatura senza ebollizione il campione; pertanto, una vasta gamma di proteine può essere controllata con DSC.

Mentre DSC è un approccio relativamente veloce e semplice per determinare la stabilità termica dei biologici, non è senza limitazioni. In primo luogo, la basepasso linea di sottrazione introduce una qualche forma di incoerenza umana nell'analisi dati grezzi; pertanto, variazioni risultati possono essere osservati tra diversi utenti. In secondo luogo, differenziali calorimetri di scansione hanno limiti minimi di concentrazione che potrebbero essere difficili da realizzare su scala produzione di massa. In terzo luogo, la d H di irreversibile denaturazione termica non è assoluta; il che implica che DeltaG derivato (un indicatore della stabilità della proteina) in scenari simili può essere fuorviante. Inoltre, il metodo funziona meglio per campioni purificati. La presenza di impurità può sia causare uno spostamento del T _m se vi è una interazione con la proteina in esame, o comparsa di nuove transizioni termiche se non vi è alcuna interazione. In ogni caso queste caratteristiche extra sui termogrammi possono essere erroneamente attribuiti ai campioni, impattando così l'interpretazione dei risultati. Nonostante queste limitazioni, DSC rimane un metodo affidabile in grado di fornire informazioni dettagliate su termodinamico °e proteine processo dispiegarsi se attuato correttamente ^42.

In conclusione, DSC offre notevole vantaggio come strumento di lettura conformazionale di prodotti vaccini e loro intermedi. I due parametri, T _m e d H, raccolti per una serie di lotti dello stesso prodotto può diventare una linea di base empirica che può essere utilizzato per esaminare l'effetto delle variazioni di processo, formulazione, e condizioni di conservazione sulla struttura terziaria e stabilità delle proteine e antigeni virali ^{^21,} ^43.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori sono molto grato a Giuseppe Mancini (già con GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments limitata) per il loro ruolo nella installazione e formazione sul calorimetro a scansione differenziale, Sasmit Deshmukh e Webster Magcalas per le loro discussioni.

Materials

Differential Scanning Calorimeter	Malvern Instruments Ltd	28428948 (Via GE Healthcare)	Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Dilute with water to 20% before use
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate	Canadian Life Science	ML072100	Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet	Labconco	Logic+ – A2	biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette	Thermo Scientific	66810 or 66380	to equilibrate the sample and buffer

Referências

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Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).