Zuordnung von RNA-RNA-Wechselwirkungen unter Verwendung von biotinyliertem Psoralen

Das Studium, wie Makromoleküle falten und miteinander interagieren, ist der Schlüssel zum Verständnis der Genregulation in der Zelle. Während in den vergangenen zehn Jahren viel Aufwand fokussiert wurde, um zu verstehen, wie DNA und Proteine ​​zur Genregulation beitragen, ist relativ wenig über die posttranskriptionelle Regulation der Genexpression bekannt. RNA trägt sowohl in ihrer linearen Sequenz als auch in ihrer sekundären und tertiären Struktur ¹ Information. Seine Fähigkeit, sich mit sich selbst und mit anderen zu paaren, ist für seine Funktion in vivo wichtig. Jüngste Fortschritte bei der Hochdurchsatz-RNA-Sekundärstruktur-Sondierung lieferten wertvolle Einblicke in die Orte von Doppel- und Einzelstrangbereichen im Transkriptom ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , HoweDie Information über die Paarungs-Interaktionspartner fehlt noch weitgehend. Um zu bestimmen, welche RNA-Sequenz mit einer anderen RNA-Region im Transkriptom interagiert ist, benötigen wir globale paarweise Informationen.

Die Abbildung von Paar-weise RNA-Interaktionen in einer globalen, unvoreingenommenen Weise war traditionell eine große Herausforderung. Während frühere Ansätze, wie CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ und RAP ¹¹ , verwendet werden, um RNA-Wechselwirkungen in einer großen Skala zu identifizieren, weisen diese Techniken typischerweise die RNA-Basenpaarung für eine Untergruppe von RNAs auf, die entweder mit einem bestimmten Protein oder einer RNA-Spezies interagieren. Zu den jüngsten Entwicklungen beim Studium globaler RNA-Wechselwirkungen gehören die Methode RPL ¹² , die RNA-Wechselwirkungen nicht in vivo stabilisiert und daher nur eine Untermenge von in vivo- Wechselwirkungen erfassen kann. Um diese Herausforderungen zu bewältigen, entwickelten wir und andere genomweite, unvoreingenommene Strategien für maP-RNA-Interactome in vivo unter Verwendung modifizierter Versionen des Vernetzers Psoralen ^{13 , 14 , 15} . In diesem Protokoll beschreiben wir die Details für die Durchführung von S- Zentren von P- Soralen-vernetzten, l- igierten und S- gewählten H- Ybriden (SPLASH), die biotinylierte Psoralen verwenden, um Basenpaarungs-RNAs in vivo zu vernetzen, gefolgt von einer Näherungsligatur und einer hohen Durchsatzsequenzierung zu Identifizieren RNA-Basenpaarungspartner genomweit ( Abbildung 1 ) ¹⁵ .

In diesem Manuskript beschreiben wir die Schritte zur Durchführung von SPLASH unter Verwendung von kultivierten adhärenten Zellen, in diesem Fall HeLa-Zellen. Das gleiche Protokoll kann leicht an Suspensions-Säugetierzellen und an Hefe- und Bakterienzellen angepasst werden. Kurz gesagt werden HeLa-Zellen mit biotinyliertem Psoralen behandelt und bei 365 nm bestrahlt, um interagierende RNA-Basenpaare in vivo zu vernetzen. Die RNAs werden dann aus den Zellen extrahiert, zersplittert und angereichert für Vernetzungsregionen unter Verwendung von Streptavidinperlen. Interagierende RNA-Fragmente werden dann unter Verwendung von Proximity-Ligation miteinander ligiert und zu einer cDNA-Bibliothek zur tiefen Sequenzierung gebracht. Nach der Sequenzierung werden die chimären RNAs auf das Transkriptom / Genom abgebildet, um die RNA-interagierenden Regionen zu identifizieren, die miteinander gepaart sind. Wir haben SPLASH erfolgreich genutzt, um Tausende von RNA-Wechselwirkungen in vivo in Hefe und verschiedenen menschlichen Zellen zu identifizieren, einschließlich intramolekularer und intermolekularer RNA-Basenpaarung in verschiedenen Klassen von RNAs wie SnoRNAs, lncRNAs und mRNAs, um in die Strukturorganisation und Interaktionsmuster einzutauchen Von RNAs in der Zelle.