الكمي للسلوك الاستمالة ذبابة الفاكهة
Summary
يصف هذا البروتوكول تقنية التحجيم الفردي الاستجالة قابلة للتحلل في ذبابة الفاكهة التي تعطي بيانات قوية، كمية لقياس السلوك الاستمالة. ويستند هذا الأسلوب على مقارنة الفرق في تراكم الصبغة على جثث الحيوانات غير مستعد مقابل الحيوانات على مدى فترة محددة من الزمن.
Abstract
سلوك الاستمالة ذبابة الفاكهة هو برنامج حركي متعدد الخطوات المعقدة التي تتطلب حركة منسقة من كل من الأفرع و هيندليغس. هنا نقدم بروتوكول الفحص الاستمالة وتصميم غرفة الرواية التي هي فعالة من حيث التكلفة وقابلة للدراسات الصغيرة أو الكبيرة على نطاق واسع من الاستمالة ذبابة الفاكهة . يتم غبار الذباب في جميع أنحاء الجسم مع صبغ أصفر باهر وإعطاء الوقت لإزالة الصبغة من أجسادهم داخل الغرفة. ثم تودع الذباب في حجم مجموعة من الإيثانول لذوبان الصبغة. يتم قياس وتسجيل الامتصاصية الطيفية النسبية لعينات الصبغة الإيثانول للحيوانات المستعد مقابل الحيوانات غير المستغلة. بروتوكول ينتج بيانات كمية من تراكم الصبغة للذباب الفردية، والتي يمكن بسهولة متوسط ومقارنة عبر العينات. وهذا يسمح التصاميم التجريبية لتقييم بسهولة القدرة الاستمالة للدراسات الحيوانية متحولة أو التلاعب الدائرة. هذا الإجراء الفعال على حد سواء تنوعا وقابلة للتطوير. نظهر wأورك تدفق البروتوكول والبيانات المقارنة بين الحيوانات وت الحيوانات المتحولة لنوع ذبابة الفاكهة I مستقبلات الدوبامين ( دوبر ).
Introduction
الاستمالة في ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ( D. ميلانوغاستر ) هو السلوك الفطري قوية التي تنطوي على تنسيق برامج المحركات المستقلة متعددة 1 . الفاكهة الذباب تنظيف أجسادهم من الغبار والميكروبات، ومسببات الأمراض الأخرى التي يمكن أن تمنع وظيفة فسيولوجية طبيعية مثل الرؤية والطيران، أو تؤدي إلى تحديات مناعية كبيرة. في الاستشعار والاستجابة لكل من الميكانيكية 2 والتنشيط المناعي 3 ، الذباب تتكاثر ساقيه بشكل متكرر أو على منطقة الجسم المستهدف حتى أنها نظيفة بما فيه الكفاية والاستمالة تقدم إلى جزء آخر من الجسم. الذباب أداء الحركات الاستمالة في نوبات متميزة التي تحدث إلى حد كبير في أنماط نمطية 1 ، 4 . ويظهر التسلسل الهرمي السلوكي كما يتم إعطاء الأولوية لإشارات التهيأ. وقد تم تحديد الدوائر وأنماط النشاط في دعم oفا نموذج أن برامج الاستمالة في الجزء العلوي من التسلسل الهرمي تحدث أولا وقمع إشارات موازية من مناطق الجسم التي يتم إعدادها في وقت لاحق 5 . وتعطى أولوية قصوى للرأس، ثم البطن، والأجنحة، وأخيرا الصدر 5 .
برنامج الاستمالة في D. ميلانوغاستر هو نظام مثالي لدراسة الدوائر العصبية، والإشارات الجزيئية مودولاتوري، والناقلات العصبية. على سبيل المثال، حل وسط من وظيفة النيوروفيبرومين 6 ، وفقدان ذبابة الفاكهة هشة X التخلف العقلي البروتين ( dfmr1 ) 7 ، والتعرض لالبسفينول A (ببا) 8 كل سبب الاستمالة المفرطة والسلوكيات الأخرى التي هي مماثلة لأعراض بشرية منفصلة من الورم العصبي الليفي، والمتلازمة، وجوانب اضطرابات طيف التوحد واضطراب فرط الحركة ونقص الانتباه (أدهد)، على التوالي. السلوك الاستمالة يمكن أيضا أن يكون هابيتواتيد تفاضليا عبر سلالات متحولة 2 ، والإقراض هذا البرنامج الحركي لدراسات اللدونة السلوكية. اتساع الظواهر العصبية التي يمكن أن تكون نموذجا من قبل ذبابة الفاكهة يتطلب نهجا مقارنة جديدة لقياس قدرة الذباب على العريس أنفسهم.
وقد تبين العمل المشترك من الناقلين أحادي الأمين الحويصلة وفرة النسبية من الدوبامين والأمينات الحيوية الأخرى في الجسم للتوسط ذبابة الفاكهة السلوك الاستمالة 9 ، 10 . أوكتوبامين والدوبامين تحفز نشاط الاستمالة هيندليغ مماثلة في الذباب ديكابيتاتد، في حين أن تيرامين، السلائف من أوكتوبامين، يؤدي أيضا الاستمالة إلى حد أقل 7 . تم التعرف على أربعة مستقبلات الدوبامين في D. ميلانوغاستر 11 ، 12 ، 13 ، 14 </sup>. باستخدام طريقة الفحص الاستمالة وصفها في هذا البروتوكول، قررنا دورا لنوع الأول دوبامين الأسرة مستقبلات دوبر ( دوبر، DDA1، البكم ) في السلوك الاستمالة هيندليغ 15 .
الاستمالة يمكن أن يكون كميا بشكل غير مباشر من خلال النظر في مدى النظافة التي الحيوان يمكن أن العريس تماما بعد غبار الجسم كله مع صبغ علامة أو غبار الفلورسنت 5 ، 16 . ما تبقى من الغبار اليسار على الجسم يمكن أن تستخدم علامة النسبية للسلوك العام. الذباب الغبار بعد إعطاء الوقت الكافي للعريس قد يظهر عجزا محددا في سلوك الاستمالة. كما أصبحت الاستمالة التحقيقات أكثر اتساعا، وأدرجت بروتوكولات مثل ممارسات قطع الرأس لإضافة العلاجات الدوائية على الرقبة الأعصاب الضامة 10 ، التحفيز عن طريق اللمس من شعيرات لانتزاع استجابة الاستمالة 2 ،وتسجيل الفيديو من السلوك 15 . الملاحظة المباشرة من الاستمالة يمكن دراستها بسهولة باستخدام المراقبة البصرية وتسجيل يدويا وتيرة ومدة الأحداث الاستمالة محددة 4 .
قمنا بتصميم غرفة الاستمالة خمسة عشر جيدا التي يمكن بناؤها مع طابعة 3D أو الليزر القاطع، وتصاميم المخطط متوفرة للاستنساخ 15 . تصميم يستخدم اثنين من لوحات الوسطى انضم مع فتحات المتطابقة وفصلها عن طريق شبكة واثنين من انزلاق لوحات أعلى وأسفل إضافية، والتي يتم تحميل الذباب و / أو الصبغة، على التوالي. بعد السماح للذباب الذباب الوقت العريس، ونحن إيداعها في الإيثانول لذوبان الصبغة وقياس امتصاص هذا الحل في الطول الموجي للصبغة. قارئ لوحة يمكن استخدامها لعينات موازية متعددة أو مقياس واحد قراءة يمكن استخدامها لعينات الفردية. هذا الأسلوب يقلل من الخطأ الناجم عن المناولة و آلانخفاض مستويات المقايسات التي يتم تشغيلها على نطاق أصغر، وكفاءة من حيث التكلفة. يتم اشتقاق هذه الطريقة وتعديلها من أساليب رائدة من قبل جولي سيمبسون وأندرو البذور، الذين يستخدمون غرف الاستمالة أكبر مع عناصر التدفئة لدرجات الحرارة الحساسة التلاعب 5 . بروتوكول التالية يعرض الكمي من الاستمالة من الجسم كله، فضلا عن عرض أساليب بديلة لكميات تراكم الصبغة على أجزاء الجسم الفردية. كما نقدم عينة من بيانات المقارنة بين المسوخ وت ودوبر ، وكذلك طرق لحساب مؤشر أداء بسيط لسلوك الاستمالة.
Protocol
Representative Results
Discussion
المقايسة هي واضحة نسبيا، ولكننا نحرص المجربين على إيلاء اهتمام خاص إلى القضايا التالية. الحفاظ على ختم ضيق عن طريق تشديد مسامير على أعلى وأسفل لوحات بعد إدخال الذباب وصبغ ضروري للنتائج استنساخه. الصبغة الصفراء الرائعة هي غرامة جدا والمفاصل فضفاضة تسمح خسائر الصبغة ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر براين شيبيرد، تات أودومريتثيروج، آرون ويلي، روبي فروم، إليز بيتمون، وروز هدرين للعمل المبكر في اختبار ووضع هذه المنهجية وتصاميم الغرفة. نشكر كيلي تليز وجراهام بوكان لقراءة وتحرير المخطوطة. نشكر أندرو البذور وجولي سيمبسون لعملهم الرائد والمشورة والدعم في اقتراح استخدام الصبغة الصفراء الرائعة (سيغما). ويدعم هذا العمل جزئيا من قبل ماري E. غروف الجراحية والبحوث الطبية والتعليم الخيرية الثقة، ومركز العلوم برونفمان، وبرنامج الزملاء هلمان.
Materials
| High-Flex Tygon PVC Clear Tubing | McMaster-Carr | 5229K54 | ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators |
| Micropipette tips (1ml and 200ul) | Genesee Scientific | 24-165, 24-150R | |
| Nylon Mesh Screen, 2" x 2.6" | McMaster-Carr | 9318T44 | Used to construct grooming chamber and mouth aspirators |
| Dumont #5 Forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5050 | |
| Brilliant Yellow Dye | Sigma-Aldrich | 201375-25G | we recommend use of nitrile gloves while handling this product |
| Vortexer | Fisher Scientific | 12-812 | set to "touch" |
| Ethanol | Carolina Biological Supply | 86-1282 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 10025-726 | |
| 0.65 ml microcentrifuge tubes | VWR International | 20170-293 | tubes can be reused with successive assays |
| UV 96 well plate | Corning | 26014017 | |
| BioTek Synergy HTX Platereader | BioTek | need to download catalog to access product number | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview |
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | BioTek | ||
| Microsoft Excel | Microsoft | https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)() | |
| Drosophila Incubator | Tritech | DT2-CIRC-TK | |
| 1/4" acrylic plastic | McMaster-Carr | 8473K341 | |
| 8-32 nuts | McMaster-Carr | 90257A009 | |
| 8-32 x 1" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A199 | the bottom plate needs to be tapped for this size screw |
| 8-32 x 1/2" hex cap screws | McMaster-Carr | 92185A194 | the second plate from the top needs to be tapped |
| 2-56 3/8" flat head phillips machine screws | McMaster-Carr | 91500A088 | these hold the two middle plates together |
| 0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe | McMaster-Carr | 92510A044 | Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws. These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate |
Referências
- Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
- Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
- Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
- Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation – Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
- Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951 (2014).
- King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
- Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100 (2011).
- Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior–a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
- Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
- Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
- Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
- Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
- Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
- Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
- Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
- Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genética. 133 (3), 581-592 (1993).
- Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758 (2015).
- Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).
