Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seqi
Summary
Burada, nöronal hücre tiplerinin izolasyondan önce sınıflandırılması ve ardından tek hücreli transkriptomların karakterizasyonu için kombinatoryal bir yaklaşım sunuyoruz. Bu protokol, başarılı RNA Sequencing (RNA-Seq) için numunelerin hazırlanmasını optimize eder ve özellikle hücresel çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için tasarlanmış bir metodoloji tanımlar.
Abstract
Hücre türüne özgü belirteçlerin keşfedilmesi, hücresel fonksiyon ve hücresel heterojenliğin kökeni hakkında bilgi sağlayabilir. Nöronal çeşitliliğin daha iyi anlaşılması için yeni bir itki ile, ifadeleri hücrelerin çeşitli alt popülasyonlarını tanımlayan genleri tanımlamak önemlidir. Retina merkezi sinir sistemi çeşitliliğinin çalışılması için mükemmel bir model olarak hizmet eder, çünkü çok sayıda ana hücre tipinden oluşur. Her büyük hücre sınıfının çalışması, bu popülasyonların tanımlanmasını kolaylaştıran genetik belirteçler verdi. Bununla birlikte, bu önemli retinal hücre sınıflarının her birinde çok sayıda alt hücre tipi mevcuttur ve pek çoğu morfoloji veya fonksiyonla karakterize olmasına rağmen, bu alt tiplerin az bilinen genetik belirteçleri vardır. Bireysel retinal alt tipler için bir genetik belirteç bilgisi, belirli görsel fonksiyonlarla ilgili beyin hedeflerinin çalışılması ve haritalandırılması için izin verir ve ayrıcaHücresel çeşitliliği muhafaza edin. Alt tiplerin genetik belirteçlerini belirlemek için kullanılan cari yollar, sıralamayı takiben hücre tiplerinin sınıflandırılması gibi dezavantajlara sahiptir. Bu, veri analizi için bir zorluk oluşturuyor ve kümelerin aynı işleve sahip hücreler içerdiğinden emin olmak için titiz doğrulama yöntemleri gerektiriyor. İzolasyon ve sıralama öncesinde bir hücrenin morfolojisini ve işlevselliğini tanımlamak için bir tekniği öneriyoruz, bu da alt tipe özgü belirteçlerin daha kolay tanımlanmasını sağlayacaktır. Bu teknik, nöronal olmayan hücre tiplerine ve küçük varyasyonlar gösteren nadir hücre popülasyonlarına kadar uzatılabilir. Çoğu kütüphane, tek hücreler için 20 milyondan fazla okuma derinlikleri sağladığından, bu protokol mükemmel kalitede veri üretir. Bu metodoloji, Tek hücreli RNA-Seq tarafından sunulan engellerin çoğunun üstesinden gelir ve hücre tiplerini basit ve etkili bir şekilde profillemeyi amaçlayan araştırmacılar için uygun olabilir.
Introduction
Nöronal çeşitlilik merkezi sinir sistemi boyunca, özellikle retinal progenitör hücreler 1 , 2 , 3'ün bir popülasyonundan ortaya çıkan, 1 glial ve 6 nöronal hücre tipinden oluşan, son derece uzmanlaşmış bir doku olan omurgalı retinada gözlemlenir. Birçok alt hücre tipi işlevsel, morfolojik ve genetik olarak sınıflandırılabilir. Bu protokolün amacı hücre tiplerinin genetik değişkenliğini tanımlanabilir işlevsel ve / veya morfolojik özelliklerine bağlamaktır. Hücrelerin sınıflandırılması için bir dizi gen tanımlanmıştır, ancak genel popülasyonun küçük bir bölümünü oluşturduğu için birçok alt tip karakterize edilmeye devam etmektedir. Bu spesifik alt tiplerdeki genlerin tanımlanması, retinadaki nöronal çeşitliliğin daha iyi anlaşılmasına ve başka yerlerde sinir hücrelerinin çeşitlenmesine ışık tutabilir. FuAyrıca, tek hücreli çalışmalar, genel nüfus 4 , 5 , 6 , 7 arasında gösterilememeleri nedeniyle gözden kaçmış olabilecek yeni hücre tiplerinin ortaya çıkmasına izin verir.
Tek hücre transkriptomisinin faydalarından biri, belirli bir hücresel alt türü tanımlayan eşsiz belirteçlerin veya işaretçilerin kombinasyonlarının keşfedilmesidir. Bunlar daha sonra farklı manipülasyonlar için o hücre türüne genetik erişim elde etmek için kullanılabilir. Örneğin, bu protokol, fotopigment melanopsini ifade eden bir retina ganglion hücresi alt grubunun hücre tipine özgü genleri karakterize etmek için kullanıyoruz. Melanopsin ifade retinal gangliyon hücrelerinde bir flüoresan markör kullanımı, bu hücrelerin bilinen bir genin ekspresyonu nedeniyle birlikte kümelenmiş olarak çalışmasını sağlar. İlginçtir ki, bu hücre popülünün bilinen beş alt türü vardırFare retinasındaki lation 8 . Böylece, RNA'yı her türün hücrelerinden izole etmek için, hücre izolasyonundan önce her alt türün tanımlanması için transjenik model içinde yerleşik morfolojik sınıflamaları kullandık. Bu teknik, hücrelerin içinde stres tepkisine neden olabilecek doku ayrışması ve parçalanmış dendritler nedeniyle kontaminasyona neden olmadan, hücrelerin tanımlanmasına ve retinadan doğrudan izole edilmesine imkan verir 9 .
RNA-Seq yöntemi geliştikçe, son birkaç yılda birçok yeni teknik ortaya çıkmıştır. Bu araçlar eldeki soruna yaklaşırken 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 nolu numaralı hücrelerin toplanmasını ve daha fazla maliyet etkinliği sağlar. Ancak, süreBu teknikler mükemmel basamak taşı olmuştur, hala bu protokolün adresleyebileceği birçok engeli vardır. Birincisi, mevcut prosedürlerin birçoğu hücreleri ayrışmış dokudan ayırır ve hücre sınıflandırmasını belirlemek için post-hoc ya ana bileşen analizi ya da hiyerarşik kümeleme kullanmaya çalışır. Alt tipleri sınıflamak için bu araçlara güvenmek, güvenilir sonuçlar vermeyebilir ve bir genetik işaretin fonksiyonel bir hücre türüne korelasyonu için bu verileri doğrulamanın yeni yollarını bulmaya zorlayabilir. Diğer protokollerde ayrılma gereksinimi bazen doku hasarına neden olabilir ve nöronal proseslerin kopmasına neden olarak mRNA'nın potansiyel bir kaybına neden olabilir. Dahası, ayrışmış hücre preparatlarında stres tepkileri, bu hücrelerin transkriptomlarını etkilemeye başlayabilir 14 . Bu protokol, izolasyondan önce işlevsel hücre türünü belirleyerek bu zorlukların üstesinden gelir veRetinal dokuyu bozulmadan tutarak hücrelerin sağlıklı kalmasını sağlar.
Bir teknik 2014 yılında tanıtıldı ve canlı hücrelerin transkriptomunun in vivo analizinden oluşuyordu 15 . Bu teknik dokuya asgari mekanik bozulma ile transkriptomun incelenmesine izin verirken, çok özel bir muhabir fare kullanmadan transkriptomlarını incelemeden önce dokudaki spesifik hücre tiplerini sınıflandırma yeteneğinden yoksundur. İzolasyonundan önce hücreleri karakterize etmek için hücre doldurma ve elektrofizyolojiyi kullandığımız için, protokolümüzde belirli bir muhabir kullanılmasına gerek yoktur. Bu önceki protokolün diğer bir kısıtlaması, fotoaktivite edilebilir elementi uyarmak için spesifik bir dalga boyu gerektirmesidir; oysa protokolümüz, kolayca bulunabilen veya her laboratuvar tarafından ayrı ayrı seçilebilen bir flüoresan muhabirinin ve floresan boyanın kullanımına izin vermektedir. Yine de, diğer laboratuvarlar iki elektrık yöntemini evlendilerOfiyoloji ve transkriptomikler gibi konularda bilgi verir. Bir hücrenin izolasyondan önce fonksiyonunu karakterize etmek için yama-klemp kayıtlarının kullanılması, ayrışmış nöronlar 16 üzerinde gerçekleştirildi ve bazı vakalarda, bu çalışmalar için mikro-dizi analizi 17'den önce geldi. Bu yaklaşımlarla aynı komplikasyonlara rastlanır çünkü bunlar, doku ayrışması veya numunelerin kullanılabilir problara hibridize edilmesine dayanan mikroarray teknolojisinin kullanılması gerektirir. En yeni gelişmelerden biri, tam beyin dilimlerinden gelen hücreleri anlamak için patch-clamp kayıtlarının ve RNA-Seq teknolojisinin kullanımını birleştiren bir teknik olan Patch-Seq'in geliştirilmesidir18. Bu teknik burada sunulan protokole benzemekle birlikte, yaklaşımımızın dokuların hücrelerin sağlığı için bozulmadan kalmasını sağladığına dikkat etmek önemlidir. Burada optimizat için bir protokol sunmaktayız.Yüksek okuma derinliği ve haritalama kapsamı elde etmek için RNA-Seq kullanımı için yüksek kalitede, tek hücreli kütüphaneler üreten bu ittifakın iyonu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolümüz, hızlı ve kolay bir kullanım kılavuzunda, numuneye az zarar veren, yüksek kaliteli sıralama için tanımlanmış morfolojik sınıfların tek hücrelerini hazırlamak için bir yöntem göstermektedir. Mevcut el yazmada, esas olarak duyarlı retina ganglion hücreleri morfolojik olarak karakterize edilir, izole edilir ve RNA-Seq için hazırlanır. Hücresel stresler retina kullanımı sırasında ortaya çıkabilir; Bu nedenle, en fazla 4 saat kullanımdan sonra her bir doku parçasını değiştir…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Numunelerin hazırlanması ve işlenmesinde kendilerine yardımcı olması için Jennifer Bair ve Einat Snir'in yanı sıra Iowa Üniversitesi İnsan Genetiği Enstitüsü'nü kabul etmek istiyoruz.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
Referências
- Austin, C., Cepko, C. L. Specification of Cell Fate in the Vertebrate Retina. Neural Cell Specif. 3, 139-143 (1995).
- Masland, R. H. The Neuronal Organization of the Retina. Neuron. 76 (2), 266-280 (2012).
- Rodieck, R. . The First Steps in Seeing. , (1998).
- Chiu, I. M., et al. Transcriptional profiling at whole population and single cell levels reveals somatosensory neuron molecular diversity. Elife. 3, e04660 (2014).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nat. Neurosci. 19 (2), 335-346 (2016).
- Trapnell, C. Defining cell types and states with single-cell genomics. Genome Res. 25 (10), 1491-1498 (2015).
- Zeisel, A., et al. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Schmidt, T. M., Do, M. T. H., Dacey, D., Lucas, R., Hattar, S., Matynia, A. Melanopsin-Positive Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells: From Form to Function. J. Neurosci. 31 (45), 16094-16101 (2011).
- Eberwine, J., Miyashiro, K., Kacharmina, J. E., Job, C. Local translation of classes of mRNAs that are targeted to neuronal dendrites. Proc. Natl. Acad. Sci. 98 (13), 7080-7085 (2001).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nat. Neurosci. 18 (1), 145-153 (2015).
- Poulin, J. F., Zou, J., Drouin-Ouellet, J., Kim, K. Y. A., Cicchetti, F., Awatramani, R. B. Defining midbrain dopaminergic neuron diversity by single-cell gene expression profiling. Cell. Rep. 9 (3), 930-943 (2014).
- Gross, A., Schoendube, J., Zimmermann, S., Steeb, M., Zengerle, R., Koltay, P. Technologies for Single-Cell Isolation. Int. J. Mol. Sci. 16, 16897-16919 (2015).
- Lovatt, D., et al. Transcriptome in vivo analysis (TIVA) of spatially defined single cells in live tissue. Nat Methods. 11 (2), 190-196 (2014).
- Qiu, S., et al. Single-neuron RNA-Seq: Technical feasibility and reproducibility. Front. Genet. 3 (124), 1-8 (2012).
- Subkhankulova, T., Yano, K., Robinson, H. P. C., Livesey, F. J. Grouping and classifying electrophysiologically-defined classes of neocortical neurons by single cell, whole-genome expression profiling. Front. Mol. Neurosci. 3 (10), 1-11 (2010).
- Fuzik, J., et al. Integration of electrophysiological recordings with single-cell RNA-seq data identifies neuronal subtypes. Nat. Biotechnol. 34 (2), 175-183 (2016).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. An isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells. J. Vis. Exp. (47), e2367 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29 (2), 476-482 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Structure and Function of Bistratified Intrinsically Photosensitive Retinal Ganglion Cells in the Mouse. J Comp Neurol. 519 (8), 1492-1504 (2011).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Differential cone pathway influence on intrinsically photosensitive retinal ganglion cell subtypes. J Neurosci. 30 (48), 16262-16271 (2010).
- Clontech Laboratories I. . SMARTerTM Ultra Low RNA Kit for Illumina® Sequencing. , (2013).
- Trombetta, J. J., Gennert, D., Lu, D., Satija, R., Shalek, A. K., Regev, A. Preparation of single-cell RNA-Seq libraries for next generation sequencing. Curr. Protoc. Mol. Biol. 4 (22), 1-17 (2014).
- Ecker, J. L., et al. Melanopsin-expressing retinal ganglion-cell photoreceptors: Cellular diversity and role in pattern vision. Neuron. 67 (1), 49-60 (2010).
- Schmidt, T. M., et al. A Role for Melanopsin in Alpha Retinal Ganglion Cells and Contrast Detection. Neuron. 82 (4), 781-788 (2014).
- Sanes, J. R., Masland, R. H. The Types of Retinal Ganglion Cells: Current Status and Implications for Neuronal Classification. Annu. Rev. Neurosci. 38, 221-246 (2014).
- Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons. J. Vis. Exp. , e3824 (2012).
- Trimarchi, J. M., et al. Molecular Heterogeneity of Developing Retinal Ganglion and Amacrine Cells Revealed through Single Cell Gene Expression Profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
