Enkeltcelle RNA-Seq av definerte subsets av retinal Ganglion-celler

Neuronal mangfold er observert gjennom sentralnervesystemet, spesielt i ryggradshinnen, et høyt spesialisert vev som består av 1 glial og 6 nevrale celletyper som oppstår fra en populasjon av retinale stamceller ^{1 , 2 , 3} . Mange subtyper av celler kan klassifiseres funksjonelt, morfologisk og genetisk. Målet med denne protokollen er å knytte den genetiske variabiliteten til celletyper til deres identifiserbare funksjonelle og / eller morfologiske egenskaper. En rekke gener er identifisert for klassifisering av celler, men mange subtyper fortsetter å gå ukarakterisert, da de representerer en liten del av den totale befolkningen. Identifikasjonen av gener innenfor disse spesifikke subtypene vil muliggjøre en større forståelse av neuronal mangfold i retina og kan også kaste lys over diversifiseringen av nevrale celler andre steder. FuVidere kan enkeltcellede studier muliggjøre avdekking av nye celletyper, som kanskje har blitt oversett på grunn av deres lave representasjon blant den samlede befolkningen ^{4 , 5 , 6 , 7} .

En av fordelene ved enkeltcelletranscriptomikk er at unike markører eller kombinasjoner av markører som definerer en bestemt cellulær subtype, kan oppdages. Disse kan da brukes til å få genetisk tilgang til den celletypen for forskjellige manipulasjoner. For eksempel bruker vi denne protokollen til å karakterisere celletypespesifikke gener av en delmengde av retinale ganglionceller som uttrykker fotopigmentet melanopsin. Bruken av en fluorescerende markør i melanopsin-uttrykkende retinale ganglionceller gjør det mulig å studere disse cellene, da de blir klynget sammen på grunn av deres uttrykk for et kjent gen. Interessant er det fem kjente undertyper av denne cellen popuLation i muslinen ⁸ . For å isolere RNA fra celler av hver type har vi således brukt etablerte morfologiske klassifikasjoner innenfor den transgene modellen for å identifisere hver subtype før cellisolasjon. Denne teknikken tillater karakterisering av celler så vel som isolasjon direkte fra netthinnen, uten behov for vevsdissociasjon, noe som kan forårsake stressrespons i celler og forurensning på grunn av avskårne dendriter ⁹ .

En rekke nye teknikker har kommet til lys de siste årene, ettersom RNA-Seq-metoden fortsetter å utvikle seg. Disse verktøyene tillater maksimert celleoppkjøp og større kostnadseffektivitet mens du nærmer deg spørsmålet ved hånden ^{4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13} . Imidlertid, mensDisse teknikkene har vært gode stepping stones, det er en rekke hindringer fortsatt oppdaget at denne protokollen er i stand til å adressere. Først isolerer mange av de nåværende prosedyrene celler fra dissociert vev og forsøker å bruke enten hovedkomponentanalyse eller hierarkisk clustering post-hoc for å bestemme celleklassifisering. Å stole på disse verktøyene for å klassifisere undertyper, kan ikke produsere pålitelige resultater og kan tvinge en til å finne nye måter å validere disse dataene for korrelasjonen av en genetisk markør til en funksjonell celletype. Kravet på dissosiasjon i andre protokoller kan noen ganger føre til vevskader og kan føre til at neuroneprosesser blir kuttet, noe som resulterer i et potensielt tap av mRNA. Videre kan i spredte cellepreparater begynne å påvirke transkriptomene av disse cellene ¹⁴ . Denne protokollen overvinter disse utfordringene ved å bestemme funksjonell celletype før isolasjon, og det opprettholder bedre hEalth av cellene ved å holde retinal vev intakt.

En teknikk ble introdusert i 2014 og besto av in vivo analyse av transkriptomet av levende celler ¹⁵ . Mens denne teknikken tillater undersøkelse av transkriptomet med minimal mekanisk forstyrrelse av vevet, mangler det evnen til å klassifisere spesifikke celletyper i vevet før de undersøker transkriptomerene uten å bruke en meget spesifikk reportermus. Vår protokoll krever ikke en bestemt reporter, da vi bruker cellefylling og elektrofysiologi til å karakterisere celler før isolasjonen. En annen begrensning av denne tidligere protokollen er at den krever en bestemt bølgelengde for å spenne det fotoaktiverbare elementet, mens protokollen vår tillater bruk av en fluorescerende reporter og fluorescerende fargestoff, som er lett tilgjengelig eller kan velges av hver enkelt laboratorie individuelt. Likevel har andre laboratorier giftet seg med to metoder for elektrOphysiologi og transkriptomikk for studier av cellulær mangfold. Bruken av patch-clamp-opptak for å karakterisere funksjonen til en celle før isolasjonen, har blitt utført på dissocierte nevroner ^16, og i noen tilfeller har den gått foran bruken av mikroarrayanalyse ¹⁷ for disse studiene. De samme komplikasjonene oppdages av disse tilnærmingene, da de krever vevsdissociasjon eller bruk av mikroarray-teknologi, som er avhengig av hybridisering av prøver til tilgjengelige prober. En av de siste fremskrittene har vært utviklingen av Patch-Seq, en teknikk som kombinerer bruken av patch-clamp-opptak og RNA-Seq-teknologi for å forstå celler fra helhjerneskiver ¹⁸ . Selv om denne teknikken har likheter med protokollen som presenteres her, er det igjen viktig å merke seg at vår tilnærming tillater at vevet forblir intakt for cellens helse. Her presenterer vi en protokoll for optimaliseringenIon av denne alliansen, som genererer høykvalitets, single-cell biblioteker for bruk av RNA-Seq for å oppnå en høy lese dybde og kartlegging dekning.