Extrusion hydraulique de la moelle épinière et isolement de ganglions rachidiens en Rongeurs
Summary
Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Abstract
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
Introduction
L'objectif global de cette méthode est d'isoler la moelle épinière, ainsi que pour identifier et isoler les DRG 1, 2. Extrusion hydraulique de la moelle épinière est une méthode nettement plus rapide que la méthode traditionnelle d'isolement de la moelle épinière par laminectomie, soit par rupture de la colonne vertébrale une à la fois, et ce procédé réduit le risque de dommages aux tissus causés par le processus de dissection 3, 4 . DRG peut être difficile à identifier. L' identification correcte est très importante pour l' analyse des tissus, par exemple suite à une lésion du nerf sciatique. En numérotant les DRG selon leur localisation par rapport à la costae, DRG peut être identifié de manière cohérente.
Tissue isolé par les techniques démontrées ici peut être appliquée à un large éventail d'analyses , y compris Western blot 5,6, 7 qPCR et la coloration immunohistochimique 8.
Lors de l' identification DRG, il est important de tenir compte du fait que le nombre de segments de la moelle épinière est connu pour varier avec le type et la souche 9, 10, 11 animaux. Les avantages dans l'exécution de cette méthode chez la souris sont le nombre élevé de variantes génétiquement modifiées disponibles et les dépenses relativement faibles en matière de logement. Les avantages de l'utilisation des rats sont le rendement relativement élevé des tissus et si les blessures impliquant nerveuses, la procédure seront assouplies avec la taille.
Protocol
Representative Results
Discussion
Si la colonne vertébrale est perturbée, par exemple par dislocation cervicale, la moelle épinière se divisera lors de l' extrusion. Si la moelle épinière ne peut être extrudé, la colonne vertébrale peut être ajustée légèrement aux deux extrémités et la tentative d'extrusion peut être répétée. Dans le cas de la moelle épinière entière est nécessaire pour une analyse plus poussée, soit constitué par l'élargissement du col, ainsi que l'élargissement lombaire de la colonne vertébrale ne doit être coupée légèrement. Si seulement l'élargissement lombaire est nécessaire pour une analyse plus poussée, la moelle épinière doit être coupée selon le protocole actuel. La colonne vertébrale doit être redressé en utilisant le bout des doigts pour faciliter l'extrusion.
Le protocole est applicable aux rongeurs de tous âges et est ici illustrée par une souris adulte (8 semaines), un chiot de la souris (5 jours) et un rat adulte (10 semaines). Selon le type et la souche animale, le nombre de sections thoraciques et lombaires peut varier 9, </sup> 10, 11. En fonction des protéines à analyser, rongeurs adultes peuvent être perfuses avec des solutions enzymatiques d'inhibition avant l'euthanasie. Si l'exécution d'une expérience impliquant une lésion nerveuse unilatérale, la moelle épinière peut être divisée en côtés ipsilatéraux et controlatéraux à l'aide des pinces ultra-fines immédiatement après extrusion. De plus, chaque côté peut être divisée en côtés dorsal et ventral. Le tissu peut ensuite être traité pour d' autres analyses, par exemple Western blot.
Transcardial perfusion fixation avec PFA avant l'extrusion du cordon spinal doit être évité, car cela rend la moelle épinière non flexible et empêche l'extrusion de la moelle épinière hydraulique. Hydraulique extrusion de la moelle épinière se déchirer les racines dorsales. Pour les expériences où les racines dorsales attachées sont nécessaires, laminectomie est recommandé. En outre, la colonne vertébrale sont perdus meninges par extrusion hydraulique, qui peut être évité par laminectomie norme <sup class = "xref"> 3.
extrusion hydraulique de la moelle épinière et DRG isolement peut également être effectuée en utilisant un fluide cérébrospinal artificiel oxygéné (ACSF) au lieu de PBS glacé. L'utilisation de l' ACSF permet la préservation du tissu isolé dans un meilleur environnement physiologique, ce qui est particulièrement important dans le cas des enregistrements ultérieurs électrophysiologiques 12, 13. Une alternative à l' ACSF pourrait être PBS contenant 1 g / L de glucose pour la production des cultures primaires de DRG 14.
extrusion hydraulique de la moelle épinière est une méthode nettement plus rapide que la méthode traditionnelle d'isolement de la moelle épinière par laminectomie, ce qui réduit le temps de manipulation des tissus et diminue donc le risque de détérioration des protéines. Perfusion avec un fixatif avant d'isoler la moelle épinière par laminectomie peut réduire le risque de lésions des tissus lors de la dissection et pendant le retrait final de lala moelle épinière de la colonne vertébrale. Toutefois, la fixation du tissu empêche son application à des analyses telles que Western blot. Hydrauliques rendements d'extrusion structurellement des tissus intacts 3 adapté à une plus large gamme d'analyses.
identification cohérente des DRG peut être difficile. Cependant, cela est essentiel pour l' analyse des tissus, par exemple suite à une lésion du nerf sciatique. En numérotant les DRG selon leur localisation par rapport à la costae, DRG peut être identifié de manière cohérente. Coloration des tissus de la moelle épinière, ainsi que des DRG peut être optimisée en effectuant les variations de traitement des tissus illustrés décrits dans le protocole étape 7.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Materials
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
Referências
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