चूहे में रीढ़ की हड्डी और पृष्ठीय रूट ganglia के अलगाव की हाइड्रोलिक बाहर निकालना
Summary
Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Abstract
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
Introduction
इस विधि के समग्र लक्ष्य के लिए रीढ़ की हड्डी को अलग-थलग करने के साथ ही 2 की पहचान करने के लिए और, DRGs 1 को अलग-थलग करने के लिए है। रीढ़ की हड्डी के हाइड्रोलिक बाहर निकालना laminectomy से रीढ़ की हड्डी में अलगाव, एक समय में रीढ़ की कशेरुकाओं एक तोड़कर यानी के पारंपरिक तरीके की तुलना में काफी तेजी से विधि है, और इस विधि ऊतकों को नुकसान के जोखिम को विच्छेदन प्रक्रिया 3, 4 की वजह से कम कर देता है । DRGs की पहचान करना मुश्किल हो सकता है। सही पहचान ऊतक विश्लेषण के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है, जैसे sciatic तंत्रिका चोट के बाद। costae करने के लिए उनके रिश्तेदार स्थानीयकरण के अनुसार DRGs नंबर रखकर DRGs लगातार पहचाना जा सकता है।
तकनीक का प्रदर्शन यहां से अलग ऊतक पश्चिमी सोख्ता 5 सहित विश्लेषण का एक व्यापक रेंज के लिए लागू किया जा सकता है,6, 7 और qPCR immunohistochemical धुंधला 8।
जब DRGs की पहचान है, यह खाता है कि रीढ़ की हड्डी में क्षेत्रों की संख्या जानवर प्रकार और तनाव 9, 10, 11 के साथ भिन्न करने के लिए जाना जाता है में लेने के लिए महत्वपूर्ण है। चूहों में इस विधि का प्रदर्शन करने में लाभ आनुवंशिक रूप से संशोधित उपलब्ध वेरिएंट और अपेक्षाकृत कम आवास खर्च की उच्च संख्या में हैं। चूहों का उपयोग कर में लाभ अपेक्षाकृत उच्च ऊतक उपज हैं और अगर तंत्रिका चोट से संबंधित, प्रक्रिया के आकार के साथ ढील दी जाएगी।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्पाइनल कॉलम, परेशान है गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा जैसे, रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना के दौरान विभाजित होगा। रीढ़ की हड्डी निकाला नहीं जा सकता है, स्पाइनल कॉलम दोनों सिरों पर थोड़ा छंटनी की जा सकती है और बाहर निकालना प्रयास दोहराया जा सकता है। पूरे मामले में रीढ़ की हड्डी के आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक है, यानी गर्भाशय ग्रीवा वृद्धि के साथ ही काठ का इज़ाफ़ा से मिलकर, स्पाइनल कॉलम में केवल थोड़ा छंटनी की जानी चाहिए। केवल काठ का इज़ाफ़ा आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक है, तो रीढ़ की हड्डी वर्तमान प्रोटोकॉल के अनुसार छंटनी की जानी चाहिए। स्पाइनल कॉलम बाहर निकालना कम करने के लिए उंगलियों का उपयोग कर सीधा किया जाना चाहिए।
प्रोटोकॉल सभी उम्र के मूषक के लिए लागू है और यहाँ एक वयस्क माउस (8 सप्ताह), एक माउस पिल्ला (5 दिन) और एक वयस्क चूहे (10 सप्ताह) द्वारा उदाहरण है। पशु प्रकार और तनाव के आधार पर, वक्ष और काठ वर्गों की संख्या 9 भिन्न हो सकते हैं, </sup> 10, 11। प्रोटीन पर निर्भर करता है कि विश्लेषण किया जाना, वयस्क मूषक इच्छामृत्यु के लिए पहले एंजाइम बाधा समाधान के साथ भरकर रखा जा सकता है। अगर एक प्रयोग एक तरफा तंत्रिका चोट से जुड़े प्रदर्शन, रीढ़ की हड्डी अल्ट्रा ठीक चिमटी का उपयोग कर तुरंत बाहर निकालना के बाद ipsilateral और contralateral पक्षों में विभाजित किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रत्येक पक्ष पृष्ठीय और उदर पक्षों में विभाजित किया जा सकता है। ऊतक तो आगे के विश्लेषण, जैसे पश्चिमी सोख्ता के लिए कार्रवाई की जा सकती है।
पीएफए रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना से पहले साथ Transcardial छिड़काव निर्धारण, बचा जाना चाहिए के रूप में इस रीढ़ की हड्डी गैर लचीला renders और रीढ़ की हड्डी हाइड्रोलिक बाहर निकालना रोकता है। हाइड्रोलिक रीढ़ की हड्डी बाहर निकालना पृष्ठीय जड़ों से दूर आंसू जाएगा। प्रयोगों जहां जुड़ी पृष्ठीय जड़ों आवश्यक हैं के लिए, laminectomy की सिफारिश की है। इसके अलावा, रीढ़ की हड्डी तानिका हाइड्रोलिक बाहर निकालना है, जो मानक laminectomy से बचा जा सकता द्वारा खो रहे हैं <suपी वर्ग = "xref"> 3।
रीढ़ की हड्डी और डीआरजी अलगाव की हाइड्रोलिक बाहर निकालना भी ठंडा पीबीएस के बजाय ऑक्सीजन युक्त कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) का उपयोग किया जा सकता है। ACSF के उपयोग के लिए एक बेहतर मनोवैज्ञानिक वातावरण, जो बाद में electrophysiological रिकॉर्डिंग 12, 13 के मामले में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है में अलग ऊतक के संरक्षण के लिए अनुमति देता है। ACSF के लिए एक वैकल्पिक पीबीएस 1 जी / प्राथमिक डीआरजी संस्कृतियों 14 की पीढ़ी के लिए एल ग्लूकोज युक्त हो सकता है।
रीढ़ की हड्डी के हाइड्रोलिक बाहर निकालना laminectomy से रीढ़ की हड्डी अलगाव के पारंपरिक तरीके, ऊतक से निपटने के समय को कम करने और इसलिए प्रोटीन के नुकसान का खतरा कम की तुलना में काफी तेजी से विधि है। एक लगानेवाला के साथ छिड़काव से पहले laminectomy से रीढ़ की हड्डी को अलग-थलग विच्छेदन के दौरान और के अंतिम हटाने के दौरान ऊतकों को नुकसान का खतरा कम हो सकता करने के लिएस्पाइनल कॉलम से रीढ़ की हड्डी। हालांकि, ऊतक निर्धारण इस तरह के पश्चिमी सोख्ता के रूप में विश्लेषण करने के लिए इसके लागू अलग करता है। हाइड्रोलिक बाहर निकालना पैदावार संरचनात्मक रूप से क्षतिग्रस्त ऊतकों को 3 विश्लेषण की एक व्यापक श्रृंखला के लिए उपयुक्त है।
DRGs की लगातार पहचान मुश्किल हो सकता है। हालांकि, इस जैसे sciatic तंत्रिका चोट के बाद ऊतक विश्लेषण के लिए आवश्यक है। costae करने के लिए उनके रिश्तेदार स्थानीयकरण के अनुसार DRGs नंबर रखकर DRGs लगातार पहचाना जा सकता है। रीढ़ की हड्डी के ऊतकों का धुंधला DRGs के रूप में रूप में अच्छी तरह प्रोटोकॉल चरण 7 में उल्लिखित सचित्र ऊतक उपचार बदलाव के प्रदर्शन से अनुकूलित किया जा सकता है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Materials
| Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
| Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
| Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
| Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
| Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
| Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
| Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
| Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
| Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
| Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
| Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
| Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
| RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
| Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
| Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
| Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
| Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
| Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
| Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
| Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
| Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
| Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
| Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
| TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |
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