Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) worden gedefinieerd als zowel de menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en de menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), en hebben de unieke mogelijkheid om niet alleen zelf-vernieuwing onder passende groei voorwaarden, ondergaan maar ook het vermogen om te differentiëren tot alle celtypes afgeleid uit de drie lagen van de kiem: ectoderm, endoderm en mesoderm¹. Als gevolg van deze unieke vermogens houden hPSCs grote belofte voor regeneratieve geneeskunde, ziekte modellering en cel-gebaseerde therapieën². Terwijl meerdere celtypen hebben met succes zijn onderscheiden van hPSCs, is één grote uitdaging de in vitro -specificatie van uitsluitend volwassene-achtige hPSC afkomstige hematopoietische cellen van de stam (HSCs) en definitieve hematopoietische progenitorcellen.

Een waarschijnlijk hinderpaal voor de ontwikkeling van de menselijke HSCs van hPSCs is de aanwezigheid van meerdere hematopoietische programma’s binnen de menselijke embryo’s³. Het eerste programma dat naar voren komt, genoemd “primitieve Haematopoiese,” afkomstig is binnen de extraembryonic dooierzak weefsel en beste wordt gekenmerkt door zijn vluchtige productie van erytroblast progenitoren (EryP-CFC), macrofagen en megakaryocytes. Met name dit programma doet geen aanleiding geven tot HSCs, noch geeft het aanleiding tot T en B lymfoïde progenitoren. De dooierzak geeft Transient echter aanleiding tot beperkte definitieve hematopoietische progenitorcellen, zoals de erytro-myeloïde voorlopercellen (EMP^4,5,6,7,8) en de erythroid-deficiënte lymfoïde-primer multipotente voorlopercellen (LMPP⁹). Noch EMPs, noch LMPPs zijn echter volledig multipotente, of staat van HSC-achtige engraftment in volwassen ontvangers. Daarentegen verderop in de ontwikkeling, is het klassiek gedefinieerde “definitief” hematopoietische programma opgegeven in de regio van de aorta-gonaden-mesonephros van het embryo zelf, die aanleiding geven tot alle volwassen hematopoietische lineages, met inbegrip van de HSC. De specificatie van deze intra embryonale definitieve hematopoietische stamcellen treedt op in een inkeping-afhankelijke manier, via een endotheel-naar-hematopoietische overgang van hemogenic endotheel (HE)^{3,10,11 ,12,13,14}. Afgezien van reconstitutie capaciteit, kunnen de multilineage potentiële en Notch-afhankelijkheid van deze cellen worden gebruikt om te onderscheiden deze definitieve hematopoietische progenitorcellen van de EMP en de LMPP (herzien in verwijzingen^3,13 ).

Inzicht in het bestuur van primitieve en definitieve hematopoietische specificatie van hPSCs mechanism(s) is waarschijnlijk cruciaal voor de reproduceerbare productie van definitieve hematopoietische progenitorcellen in allerlei hPSC lijnen. Tot voor kort bestond hPSC differentiatie protocollen die multipotente primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen scheiden kon niet^{15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25}. Vele benaderingen met foetale runderserum (FBS) en/of stromale co cultuur eerst geschetst het hematopoietische potentieel van hPSC differentiatie, met mengsels van primitieve en definitieve hematopoietische potentiële^{15,16, 17,19,22,23,25}. Verder veel serumvrij hematopoietische protocollen hebben beschreven de signaal-eisen voor de specificatie van mesoderm uit hPSCs die havens hematopoietische potentiële^{18,20,21, 24}. aangezien deze methoden nog steeds gaf aanleiding tot heterogene mengsels van beide programma’s, hun gebruik in klinische toepassingen en begrijpen van ontwikkelingsstoornissen mechanismen kunnen echter beperkt.

We hebben onlangs gebouwd op deze studies, hebben geschetst van de fase-specifieke signaal eisen voor ACTIVIN/NODAL en WNT signalering in primitieve en definitieve hematopoietische specificatie van hPSC afkomstige mesoderm^18,26 . De laatste was bijzonder uniek, omdat het gebruik van fase-specifieke WNT signaal manipulatie voor de specificatie van uitsluitend primitief of uitsluitend definitieve hematopoietische progenitorcellen^{26 zorgt}. Tijdens mesoderm specificatie, de remming van het canonieke WNT signalering met de PORCN-remmer IWP2 resulteert in de specificatie van CD43⁺ EryP-CFC- en myeloïde voorlopercellen, met geen detecteerbare lymfoïde potentieel. In schril contrast, stimulatie van het canonieke WNT signalering met de GSK3β-remmer, CHIR99021, tijdens dezelfde ontwikkelingsfase differentiatie resulteerde in de totale afwezigheid van detecteerbare CD43⁺ EryP-CFC, terwijl het tegelijkertijd leiden tot de specificatie van de CD34⁺CD43⁻ HE. Deze bevolking bezeten myeloïde, HBG-erythroid en T-lymfoïde potentieel. Latere analyses vastgesteld dat hij als ontbreekt de uitdrukking van CD73^27,28 , CD184²⁸, en haar hematopoietische mogelijke NOTCH-afhankelijke²⁸was. Verdere, eencellige klonale analyses aangetoond dat deze definitieve hematopoietische lineages kon worden afgeleid uit enige Multipotente cellen²⁸. Samen genomen, blijkt deze studies dat stadium-specifieke WNT signalering manipulatie pure primitieve hematopoietische progenitorcellen of multipotente NOTCH-afhankelijke definitieve hematopoietische progenitorcellen kunt opgeven.

We schetsen hier, onze strategie van de differentiatie, dat de opbrengst uitsluitend primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen, via manipulatie van canonieke WNT signalering tijdens mesodermal patronen, en hun downstream hematopoietische afstamming testen. Dit protocol is van grote waarde voor onderzoekers die geïnteresseerd in de productie van primitieve of definitieve hematopoietische progenitorcellen van hPSCs voor regeneratieve geneeskunde toepassingen zijn.