Non invasivo<em> In Vivo</em> Fluorescenza ottica di imaging dell'attività MMP infiammatoria utilizzando un agente fluorescente di imaging attivo
Summary
Questo articolo spiega l'applicazione dell'immagine fluorescente utilizzando una sonda ottica attivabile per la visualizzazione dell'attività in vivo delle metalloproteinasi di matrici chiave in due diversi modelli sperimentali di infiammazione.
Abstract
In questo articolo si descrive un metodo non invasivo per l'attività di matrice metalloproteinasi (MMP) di imaging mediante una sonda fluorescente attiva, tramite l' ottica ottica (OI) in fluorescenza in vivo , in due diversi modelli di infiammazione: un artrite reumatoide (RA) e un contatto Modello di reazione di ipersensibilità (CHR). La luce con una lunghezza d'onda nella finestra vicino a infrarossi (NIR) (650 – 950 nm) consente una penetrazione più profonda del tessuto e un assorbimento minimo del segnale rispetto alle lunghezze d'onda inferiori a 650 nm. I principali vantaggi che usano l'OI di fluorescenza è che è conveniente, veloce e facile da implementare in diversi modelli animali.
Le sonde fluorescenti attivatabili sono otticamente silenziose nei loro stati inattivati, ma diventano altamente fluorescenti quando attivata da una proteasi. I MMP attivati portano alla distruzione dei tessuti e svolgono un ruolo importante per la progressione della malattia nelle reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR) come RA e CHR. Inoltre, i MMP sonoLe proteasi chiave per la cartilagine e il degrado dell'osso e sono indotti da macrofagi, fibroblasti e condrociti in risposta a citochine pro-infiammatorie. Qui usiamo una sonda che viene attivata dai MMP chiave come MMP-2, -3, -9 e -13 e descrivono un protocollo di imaging per l'attività di fluorescenza vicino all'infrarosso OI dell'attività MMP in RA e nei topi di controllo 6 giorni dopo l'induzione della malattia Come nei topi con l'acuto (1x challenge) e la cronica (5x challenge) CHR sull'orecchio destro rispetto alle orecchie sane.
Introduction
Le malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide (RA) o la psoriasi vulgaris sono classificate come reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR). 1 RA è una malattia autoimmune comune caratterizzata da sinovite erosiva e distruzione congiunta. 2 Le articolazioni artrite infiammate dimostrano l'infiltrazione e la proliferazione delle cellule infiammatorie, una maggiore espressione di cellule pro-infiammatorie che portano alla formazione di pannus, alla cartilagine e alle distruzioni dell'osso. 3 , 4 La scissione di molecole di matrice extracellulare, come il collagene mediante matrici metalloproteinasi (MMPs), è essenziale per la conversione e l'angiogenesi dei tessuti e provoca distruzioni del tessuto. 5 , 6 Le reazioni di ipersensibilità di contatto (CHR) sono caratterizzate dall'aggregazione di neutrofili che portano ad uno scoppio ossidativo. 7 Simili a RA, i MMP in CHR sono involved nella conversione dei tessuti, la migrazione cellulare e l'angiogenesi per stabilire infiammazione cronica.
Per studiare RA, il glucosio-6-fosfato isomerasi (GPI) iniezione -serum modello di topo è stato utilizzato. 8 siero di topi K / BXN transgeniche contenenti anticorpi contro GPI, è stato iniettato in topi BALB / c naive dopodiché infiammazione reumatica cominciato a svilupparsi entro 24 h con un massimo di edemi declivi il giorno 6 dopo l'iniezione GPI-siero (vedi 1.1). Per analizzare CHR cronica, topi C57BL / 6 sono stati sensibilizzati con trinitrochlorobenzene (TNCB) sull'addome. L'orecchio destro è stato sfidato fino a 5 volte a partire 1 settimana dopo la sensibilizzazione (vedi anche 1.1 e 1.2).
Non invasiva piccoli animali OI è una tecnica basata sulle indagini in vivo del fluorescente-, chemiluminescent- e bioluminescenti-segnali, che vengono utilizzati principalmente nella ricerca preclinica. I dati semiquantitativa acquisita dà intuizioni nel MolecMeccanismi Ular negli organi e tessuti sani e modelli animali sperimentali malati, e consente longitudinale follow up misure (ad esempio per valutare profili di risposta terapeutica in vivo). Un grande vantaggio di studi longitudinali è la riduzione del numero di animali, come gli stessi animali possono essere misurati in studi di follow up in diversi punti temporali invece di utilizzare mouse diversi per punto temporale. La risoluzione di OI permette imaging funzionale dettagliata di organi e strutture tissutali più piccole in animali da esperimento.
L'uso di specifici filtri eccitazione e di emissione con uno spettro di trasmissione ristretta, una protezione contro luce diffusa da una tenuta di luce "scatola scura" ed un dispositivo charged-coupled sensibili (CCD), che viene raffreddata in molti dispositivi fino a -70 ° C , permette altamente specifico e misurazioni sensibili dei segnali di fluorescenza.
Utilizzando agenti fluorescenti con excitation- eGli spettri di emissione nella finestra di fluorescenza ad infrarossi vicino (650 – 950 nm), i rapporti segnale-rumore possono essere migliorati significativamente. La finestra a fluorescenza a infrarossi vicino è caratterizzata da un assorbimento relativamente basso del segnale da parte dell'emoglobina e dell'acqua così come una bassa fluorescenza di fondo. 9 Questo permette una profondità di penetrazione fino a 2 cm nel tessuto dei piccoli animali. Le sonde OI possono indirizzare direttamente un bersaglio ( ad esempio mediante un anticorpo a fluorescenza) oppure possono essere attivate nel tessuto bersaglio (per es. Mediante proteasi). Le sonde OI attuabili sono otticamente silenziose nella loro forma inattivata a causa del trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) ad una parte di quenching, che trasferisce l'energia di eccitazione all'interno della molecola ad un altro dominio. Se il colorante viene ceduto (ad esempio da una proteasi), l'energia non è più trasferita all'interno della molecola e un segnale fluorescente può essere rilevato da OI. Ciò consente la progettazione di sonde OI ad alta specificitày per processi biologici distinti ed eccellenti segnale-rumore-ratio.
Il protocollo che segue illustra in dettaglio la preparazione degli animali, le misurazioni OI utilizzando una sonda OI Activatable all'immagine MMP-2, -3, -9 e -13 attività in vivo e due modelli sperimentali di infiammazione (RA, CHR).
Protocol
Representative Results
Discussion
OI è uno strumento molto utile, veloce e poco costoso per l'imaging molecolare non invasivo in vivo nella ricerca preclinica. Una particolare forza di OI è la capacità di monitorare processi altamente dinamici come risposte infiammatorie. Inoltre, l'OI permette di seguire il corso di una malattia per un lungo periodo di tempo, che va dai giorni alla settimana.
L'OI ha diversi vantaggi rispetto ad altre modalità di imaging in vivo , come la tomografi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Daniel Bukala, Natalie Altmeyer e Funda Cay per un ottimo supporto tecnico. Ringraziamo Jonathan Cotton, Greg Bowden e Paul Soubiran per aver redatto il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Werner Siemens e dalla Facoltà di Medicina dell'Università Eberhard Karls Tübingen ('' Promotionskolleg '') e dal DFG attraverso la CRC 156 (progetto C3).
Materials
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28×0.61mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | – | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | – | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | – | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100µl) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
Referências
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