El aislamiento efectivo de los islotes funcionales de páncreas de ratón neonatales
Summary
Se describe un protocolo en el presente documento para el aislamiento de islotes intactos de ratones neonatales. Páncreas se digirieron parcialmente con colagenasa, seguido de lavado y recolección a mano. 20 – 80 grupos de los islotes se pueden obtener por el páncreas de los ratones recién nacidos, que son adecuados para diversos estudios de los islotes.
Abstract
protocolos de islotes de aislamiento a base de perfusión de grandes páncreas de mamíferos están bien establecidos. Tales protocolos se llevan a cabo fácilmente en muchos laboratorios, debido al gran tamaño del conducto pancreático que permite la inyección de colagenasa listo y la perfusión tisular subsiguiente. En contraste, el aislamiento de los islotes de páncreas pequeña, como la de los ratones recién nacidos, es un reto porque la perfusión no se puede lograr fácilmente en la pequeña páncreas. Aquí se describe un procedimiento sencillo detallada que recupera un número sustancial de los islotes de ratones recién nacidos con asistencia visual. Recién diseccionado páncreas entero se digirió con 0,5 mg / ml de colagenasa IV disuelto en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) a 37 ° C, en tubos de microcentrífuga. Los tubos se intervenidos con regularidad para ayudar a la dispersión del tejido. Cuando la mayor parte del tejido se dispersó a pequeños grupos alrededor de 1 mm, los lisados se lavaron de tres a cuatro veces con medios de cultivo con 10% de suero bovino fetal (FBS). racimos de islotes,desprovisto de tejidos acinares reconocibles, a continuación, se pueden recuperar bajo disección estereoscopio. Este método recupera 20 – 80 pequeño a islotes de gran tamaño por el páncreas de ratón recién nacido. Estos islotes son adecuados para los ensayos de aguas abajo más concebibles, incluyendo la secreción de insulina, la expresión génica, y la cultura. Un ejemplo de ensayo de secreción de insulina se presenta para validar el proceso de aislamiento. Los antecedentes genéticos y el grado de digestión son los factores más importantes que determinan el rendimiento. Se prefiere solución de colagenasa recién hecha con alta actividad, ya que ayuda en el aislamiento endocrino-exocrino. La presencia de cationes [calcio (Ca2 +) y magnesio (Mg 2+)] en todas las soluciones y suero fetal bovino en el lavado / medios de picking son necesarios para un buen rendimiento de islotes con integridad adecuada. Un microscopio de disección con un buen contraste y la ampliación también ayudará.
Introduction
Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies.
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
A continuación, ofrecemos un protocolo paso a paso en el aislamiento de los islotes del páncreas que son demasiado pequeños para la perfusión convencional. Se espera para producir islotes listos para todos los estudios basados en los islotes como la purificación de las células beta, análisis de expresión génica, la maduración de las células beta de los islotes, la proliferación, las respuestas de estrés celular, la supervivencia celular, el metabolismo y mantenimiento funcional GSIS, etc. Esta ser?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.
Materials
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1X HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrfuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
Referências
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. . Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
