A protocol for the synthesis of 1,2-azaborines and the preparation of their protein complexes with T4 lysozyme mutants is presented.
We describe a general synthesis of 1,2-azaborines using standard air-free techniques and protein complex preparation with T4 lysozyme mutants by vapor diffusion. Oxygen- and moisture-sensitive compounds are prepared and isolated under an inert atmosphere (N2) using either a vacuum gas manifold or a glove box. As an example of azaborine synthesis, we demonstrate the synthesis and purification of the volatile N-H-B-ethyl-1,2-azaborine by a five-step sequence involving distillation and column chromatography for the isolation of products. T4 lysozyme mutants L99A and L99A/M102Q are expressed with Escherichia coli RR1 strain. Standard protocols for chemical cell lysis followed by purification using carboxymethyl ion exchange column affords protein of sufficiently high purity for crystallization. Protein crystallization is performed in various concentrations of precipitant at different pH ranges using the hanging drop vapor diffusion method. Complex preparation with the small molecules is carried out by vapor diffusion method under an inert atmosphere. X-ray diffraction analysis of the crystal complex provides unambiguous structural evidence of binding interactions between the protein binding site and 1,2-azaborines.
बोरान-नाइट्रोजन heterocycles (यानी 1,2-azaborines) युक्त हाल ही में ARENES की isosteres के रूप में महत्वपूर्ण ध्यान आकृष्ट किया है। इस isosterism मौजूदा संरचनात्मक रूपांकनों के विविधीकरण के लिए नेतृत्व रासायनिक अंतरिक्ष 2, 3, 4 विस्तार करने के लिए कर सकते हैं। Azaborines विशेष रूप से औषधीय रसायन विज्ञान के क्षेत्र में जो दवा की दुकानों संरचनात्मक रूप से पुस्तकालयों और कार्यात्मक प्रासंगिक अणुओं के संश्लेषण के लिए बाहर ले जाने में, जैव चिकित्सा अनुसंधान 5, 6, 7, 8 में आवेदन के लिए संभावित उपयोगिता है। गौरतलब है कि हालांकि, जबकि वहाँ उपलब्ध arene युक्त अणुओं के लिए कई अच्छी तरह से विकसित सिंथेटिक मार्गों कर रहे हैं, केवल azaborines के संश्लेषण के लिए तरीकों की एक सीमित संख्या में सूचित किया गया है 9, 10, </s> 11, 12, 13 अप। इस बोरान स्रोत और हवा और सिंथेटिक अनुक्रम के प्रारंभिक चरण में अणु की moisture- संवेदनशील प्रकृति के लिए विकल्पों में से एक सीमित संख्या के कारण मुख्य रूप से है।
इस लेख के पहले भाग में, हम एन -TBS- बी -Cl-1,2-azaborine (3) का उपयोग कर मानक एयर मुक्त तकनीकों का एक बहु-ग्राम पैमाने संश्लेषण का वर्णन करेंगे। इस परिसर में एक बहुमुखी मध्यवर्ती कि आगे संरचनात्मक रूप से और अधिक जटिल अणुओं 14, 15 को क्रियाशील किया जा सकता है के रूप में कार्य करता है। 3 से शुरू, संश्लेषण और प्रोटीन बाध्यकारी पढ़ाई में उपयोग के लिए एन बी -H- -ethyl-1,2-azaborine (5) की शुद्धि वर्णित किया जाएगा। 5 की अस्थिरता के कारण, अपने कुशल अलगाव प्रतिक्रिया तापमान, समय, और जिले के सटीक नियंत्रण की आवश्यकता हैनतीजा शर्तों।
दूसरे भाग में, प्रोटीन अभिव्यक्ति और टी -4 लाइसोजाइम म्यूटेंट (L99A और L99A / M102Q) 17, 18, 19 के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल, 20 से प्रस्तुत किया जाएगा, प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और प्रोटीन ligand क्रिस्टल परिसरों की तैयारी द्वारा पीछा किया। टी -4 लाइसोजाइम म्यूटेंट L99A और L99A / M102Q राष्ट्रीय राजमार्ग azaborine अणुओं 17 युक्त हाइड्रोजन संबंध क्षमता की जांच के लिए जैविक मॉडल प्रणाली के रूप में चुने गए हैं। एक मानक आणविक जीव विज्ञान प्रोटोकॉल का प्रयोग, प्रोटीन कोलाई RR1 तनाव में व्यक्त किया और isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) के साथ प्रेरित है। प्रोटीन शुद्धि आयन एक्सचेंज स्तंभ क्रोमैटोग्राफी का उपयोग किया जाता है। प्रोटीन क्रिस्टलीकरण अत्यधिक ध्यान केंद्रित शुद्ध प्रोटीन समाधान (> 95% शुद्धता जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा) के साथ किया जाता है फांसी का उपयोग करवाष्प प्रसार विधि ड्रॉप। ऑक्सीजन के लिए इस अध्ययन के ligands की संवेदनशीलता की वजह से, प्रोटीन ligand परिसरों हवा मुक्त परिस्थितियों में तैयार किया जाता है।
इस प्रोटोकॉल के पहले भाग में, हम 1,2-azaborines पहले से सूचना दी तरीकों 12, 13 के आधार पर संशोधित संश्लेषण का वर्णन किया। Triallylborane 22 allyltriphenyl टिन या पोटेशियम allyltrifluoroborate का उपयोग कर तैयार करने के …
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the National Institutes of Health NIGMS (R01-GM094541) and Boston College.
Tetrahydrofuran (THF), inhibitor-free, for HPLC, ≥99.9% | Sigma Aldrich | 34865 | |
Diethyl ether (Et2O), for HPLC, ≥99.9%, inhibitor-free | Sigma Aldrich | 309966 | |
Methylene chloride (CH2Cl2), (Stabilized/Certified ACS) | Fisher | D37-20 | |
Toluene | Fisher | T290-4 | |
Pentane, HPLC | Fisher | P399-4 | |
Acetonitrile | Fisher | A21-4 | |
Calcium hydride (CaH2), reagent grade, 95% | Sigma Aldrich | 208027 | Pyrophoric |
Palladium on activated carbon (Pd/C), 10 wt% Pd | Strem | 46-1900 | |
1.0 M Boron trichloride solution in hexane | Sigma Aldrich | 211249 | Highly toxic/ Pyrophoric |
Triethylamine, ≥99.5% | Sigma Aldrich | 471283 | |
Grubbs 1st generation catalyst | materia | C823 | |
Acetamide | Sigma Aldrich | A0500 | |
n-Butanol, anhydrous, 99.8% | Sigma Aldrich | 281549 | |
Ethyllithium solution, 0.5 M in benzene/cyclohexane | Sigma Aldrich | 561452 | Highly toxic/ Pyrophoric |
HCl solution, 2.0 M in Et2O | Sigma Aldrich | 455180 | |
2-Methylbutane, anhydrous, ≥99% | Sigma Aldrich | 277258 | |
Escherichia coli, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 31343™) | ATCC | 31343 | |
T4 lysozyme WT* (L99A) | Addgene | 18476 | |
T4 lysozyme mutant (S38D L99A M102Q N144D) | Addgene | 18477 | |
Ampicillin sodium salt | Sigma Aldrich | A0166 | |
isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Invitrogen | AM9464 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | Fisher | BP329 | |
Sodium Phosphate dibasic anhydrous | Fisher | BP332 | |
Sodium chloride | Fisher | S642212 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Fisher | BP118 | |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M4880 | Corrosive |
Thermo scientific pierce DNaseI | Fisher | PI-90083 | |
GE Healthcare Sepharose Fast Flow Cation Exchange Media | Fisher | 45-002-931 | |
Tris-base | Fisher | BP152-500 | |
Sodium azide | TCI | S0489 | Highly toxic |
2-Mercaptoethanol | Fisher | ICN806443 | |
Sartorius Vivaspin 20 Centrifugal Concentrators | Fisher | 14-558-501 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
2-Hydroxyethyl disulfide | Sigma Aldrich | 380474 | |
N-paratone | Hampton Research | HR2-643 | |
4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher | 08-667E | |
CryoLoop | Hampton Research | cryogenic tubing shaped into a loop | |
CryoTong | Thermo Fisher | cryogenic tong | |
Coot | Electron density images are generated from the software |