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Medicina

Diagnóstico de romance em artroplastia de revisão: implante Sonication e reação em cadeia da polimerase Multiplex

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/55147
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1Institute of Medical Microbiology, Immunology and Parasitology,University Hospital Bonn, 2Department of Orthopaedics and Trauma Surgery,University Hospital Bonn, 3Division of EU Cooperation/Microbiology,Paul-Ehrlich-Institute

Summary

Diagnóstico diferencial em artroplastia doloroso é crucial para o sucesso do tratamento. Aspiração comum é realizada de rotina no pré-operatório. Reação em cadeia polimerase multiplex de aspirado o comum e o fluido sonication, uma ferramenta viável para a deteção de patógeno rápida destas amostras é descrita.

Abstract

Em pacientes ortopédicos, infecções associadas a corpo estrangeiras, especialmente periprotética infecções conjuntas (PJIs), são uma complicação devastadora da artroplastia. Infecção requer tratamento complexo, pode resultar em custos consideráveis longa hospitalização e causas. Múltiplas revisões cirúrgicas podem ser necessárias nesses pacientes, com uma perda de função, bem como na qualidade de vida.

O diagnóstico pré-operatório rotineiro incluem o exame de sangue para a proteína C – reativa (CRP) e outro biomarcadores, bem como análise conjunta aspirado para contagem de células, diferenciação e cultura. Intra-operatória espécimes para histologia e Microbiologia são, também, procedimento padrão. O exame microbiológico de implantes removidos com sonication, em combinação com a aplicação de técnicas de biologia molecular em microbiologia, representam duas novas técnicas atualmente empregadas para melhorar o diagnóstico diferencial de PJI.

Apresentamos aqui o procedimento passo a passo da análise conjunto aspirado e fluido sonication, usando um sistema de reação em cadeia (PCR) baseado em cartucho multiplex polimerase. Os resultados foram comparados com culturas convencionais e critérios de consenso para PJI. Culturas microbiológicas convencionais de biópsias de tecido, mista aspirado e fluido sonication mostrou uma sensibilidade de 66,7%, 66,7% e 88,9%, respectivamente e uma especificidade de 82,3% e 54,6% 61,5%, respectivamente. O PCR diagnóstico de fluido sonication e a sinovial mostrou uma sensibilidade de 50,0% e 55,6%, respectivamente e ambos uma especificidade de 100,0%. Ambos os diagnósticos PCR combinados tinham uma sensibilidade de 66,7% e uma especificidade de 100,0%. O PCR multiplex, portanto, apresenta uma rápida ferramenta de diagnóstico com sensibilidade moderada mas alta especificidade no diagnóstico de PJI.

Introduction

As artroplastias dolorosas são um desafio de diagnóstico em cirurgia ortopédica. Depois de afrouxamento asséptico, PJI é a segunda mais razão para o fracasso do implante e apresenta uma complicação devastadora após a cirurgia de artroplastia. PJI é difícil de diagnosticar e difícil de tratar. Errou o diagnóstico de um PJI irá provavelmente resultar em infecções de repetição, com maior morbidade, perda da função e perda da qualidade de vida. Portanto, a infecção deve ser descartada em todos os pacientes que apresentam com artroplastia dolorosa, antes de medidas terapêuticas são iniciadas.

O histórico do paciente, exame clínico, exame de sangue para o CRP e contagem de células brancas do sangue, bem como radiografia ou szintigraphy da articulação afetada constituem o diagnóstico básico1. A rotina pré-operatória deve incluir também uma aspiração comum sob condições estéreis, sempre que possível. O aspirado adquirido é um material muito valioso no diagnóstico ainda mais.

Além da contagem de células e diferenciação celular no aspirado conjunta como ensaios bem-estabelecida2, a detecção de biomarcadores de proteína pode ajudar no diagnóstico diferencial de4,3,5. Cultura microbiológica convencional continua a ser o padrão-ouro na deteção do patógeno. Biofilmes, causadas por bactérias gram-positivas e Gram-negativas e aderente à superfície do implante, são um fator patogênico em PJI. Portanto, em 2007, o procedimento de sonication foi implementado nos diagnósticos de estrangeiros corpo infecções associadas em cirurgia ortopédica, rompendo os biofilmes sobre implantes removidos para permitir a detecção de agentes patogénicos. As bactérias são desse modo tiradas da sua forma de descanso para uma forma ativa, tornando a detecção em cultura possíveis novamente. Sonication dos implantes removidos mostrou uma sensibilidade maior do que as culturas de tecido espécimes (78,5% vs 60,8%)6.

Teste de amplificação de ácidos nucleicos (NAT), tais como a PCR, mudou-se recentemente para o escopo de clínicos e microbiologistas para diagnosticar PJI. Especialmente em pacientes que receberam terapia antibiótica antes da cirurgia, ficou demonstrado que o diagnóstico de PCR é benéfica em identificar os organismos causadores de7,8,9. Ultimamente, foi introduzido um novo sistema PCR multiplex, especialmente concebido para o implante e o tecido de infecções (ITI). Este sistema baseado em cartucho oferece uma variedade de genômicas marcadores para identificação de patógenos e marcadores de resistência aos antibióticos. Entre a sua gama de aplicação são inúmeras indicações (próteses comuns infecções, infecções do sítio cirúrgico, infecções relacionadas a cardiologia, infecções associadas a cateter, infecções do pé diabético, profunda da pele e infecções de tecidos, implante de infecções, e infecções de ferida de queimadura), e um amplo painel de material de amostra pode ser usado para essa técnica (fluido sonication, líquido sinovial, cotonetes, tecido, pus, exsudato/aspirado e biofilme)10,11,12.

A maior vantagem do procedimento, em comparação com microbiologia convencional, é a velocidade: O patógeno causador pode ser identificado dentro de horas. Além disso, este sistema PCR detecta um amplo painel de marcadores de resistência gene codificado, permitindo o início da terapia antibiótica alvo desde o início. Com o auxílio do PCR, cirurgiões podem ser capazes de distinguir entre pacientes infectados e não infectados numa fase muito precoce do procedimento diagnóstico11. Aqui, apresentamos o protocolo para executar este PCR multiplex, rapidamente diagnosticar PJI de aspirado conjunto e sonication fluido.

Protocol

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de ética local (046/09, Rev. 3). Consentimento informado e declaração de privacidade de dados foram obtidos de todos os pacientes incluídos. 1. comum aspiração Nota: O procedimento deve ser realizado em um teatro cirúrgico ou uma sala de intervenção com condições assépticas comparáveis. Assistência por uma enfermeira ou assistência do médico é útil, mas não obrigatórios. Posicione o paciente em posição supina sobre uma cama de exame. Certifique-se de que a articulação de interesse é livre de roupa. Encurte os pelos do corpo denso ou longa usando tosquiadeiras elétricas. Não remova pelos do corpo com uma navalha. Posicione um fluoroscópio no sentido ântero-posterior, se a articulação do quadril deve ser perfurado. Se o joelho está a ser perfurado, coloque um rolo de joelho sob o joelho do paciente, de forma a que o joelho baseia-se em uma posição ligeiramente flexionado13. Preparar uma tabela de instrumento com o seguinte equipamento esterilizado: cotonetes estéreis, um pano de cobertura estéril fenestrado, um bisturi estéril descartável, lâmina pontiaguda (tipo #11) e seringa estéril de 10 mL com cânula estéril (calibre 20, 80 mm). Estabelecidos desinfectante da pele alcoólicas, tubos de colheita de sangue e um frasco de cultura de sangue pediátrica separadamente. Vestir um avental cirúrgico, capuz e máscara e colocar as luvas estéreis. Lave a pele do paciente no local da punção (por exemplo, recessus superior14 para a área de portal do joelho e ântero-lateral para o quadril) com um desinfetante de pele.Nota: Importa o tempo de exposição necessário para o desinfetante usado (geralmente 90 s no joelho, 120 s no quadril para desinfetantes alcoólicas). Cobrir o local da punção com um pano de cobertura estéril fenestrado. Identifica o local de punção.Nota: Para o joelho, o site correto é 2 cm acima do polo superior da patela e a lateral de 2 cm para a faceta lateral. Para o quadril, encontrar a espinha ilíaca ântero-superior e move-se caudalmente até que, em consonância com a sínfise superior. Certifique-se de que o site é lateral à artéria femoral (aproximadamente 4 cm), que pode sempre ser palpada15. Fazer uma incisão pequena facada através da pele (3 a 4 mm largura e profundidade) com a lâmina de bisturi apontado no local da punção. Não são aplicáveis os anestésicos locais podem causar falsos negativos na cultura microbiológica, devido a seu efeito bacteriostático. Fixe a cânula o Luer slip da seringa. Inserir a cânula através da incisão de facada. No intervalo superior da articulação do joelho, visam a um ângulo de 45°, dorsal e medial, em direção ao recesso abaixo do polo superior da patela e insira a agulha a uma profundidade de aproximadamente 5 cm. Aspire a sinovial desenhando-se para fora do pistão da seringa. Use o fluoroscópio orientação quando perfurar uma articulação do quadril. Introduza a agulha no local da punção, visando medialmente um ângulo de 60°. No fluoroscópio, certifique-se de que a ponta da agulha está apontada para o pescoço de prótese. Avança a cânula a uma profundidade de aproximadamente 8 cm (mais profundo em pacientes adiposos) enquanto aspira, até se atingir a sinovial. Segure a agulha em posição enquanto aspiração, para evitar a raspagem da superfície da prótese.Nota: O contacto da ponta da agulha com a prótese garante posição intra-articular. Geralmente, não mais que 5 mL de fluido pode ser aspirada forma uma articulação do quadril, uma articulação de joelho vai render mais de 10 mL. Após a remoção da cânula, aplica um curativo estéril para a incisão de facada. Para evitar a formação de hematoma, aplica um curativo na perna com leve compressão. Transferi o aspirado conjunto coletado em recipientes de amostra. Certifique-se de técnicas de trabalho estéril em todo. Para inoculação do frasco com o líquido aspirado conjunto cultura sangue pediátrica, Desinfecte a membrana do balão cultura sangue pediátrica com desinfectante alcoólico. Colocar uma cânula fresca para a seringa e injetar 1 a 3 mL de aspirado sinovial o frasco de cultura de sangue. Misture por suave agitação ou rotação16. Para a preparação de um espécime aspirado conjunta nativo, retire a cânula da seringa. Abra um tubo de coleta de sangue sem aditivos e injectar 1 mL de aspirado por este tubo de coleta. Substitua e aperte a tampa para análise PCR.Nota: Envie a amostra para o laboratório de microbiologia sem demora para análise PCR. Da mesma amostra, as culturas aeróbias e anaeróbicas microbiológicas convencionais também podem ser definidas até17. Transferência de 1 a 4 mL de aspirado o conjunto em um tubo de coleta de sangue contendo EDTA para2, de contagem e diferenciação celular. Envie a amostra para um laboratório de bioquímica sem qualquer atraso. 2. PCR diagnóstico Certifique-se de todos os três dispositivos (o lysator, o analisador e o cockpit; consulte a tabela de materiais) estão funcionando corretamente. Estabelecidos todos os suprimentos necessários para a realização do teste (o cartucho PCR, um tubo de mistura de mestre, o tubo de amostra e tampa tubo de amostra, um 0 – 200 micropipeta µ l e pontas de pipeta estéril) sobre a bancada de trabalho. Degele o tubo de mistura de mestre antes de iniciar o procedimento, definindo-o em temperatura ambiente. Todos os consumíveis (tubo de mistura de mestre, cartucho e tubo de amostra) já são prelabeled com um código de barras. Retire a tampa do tubo de amostra. Tomar 180 µ l da amostra coletada (aspirado conjunto, consulte a seção 1; ou fluido sonication, consulte a secção 4) com uma pipeta e transferência na amostra do tubo. Feche o tubo de amostra com a tampa do tubo de amostra contendo proteína quinase K e um gene de controle interno para o controle de qualidade de fluxo de trabalho inteiro. No cockpit, abra o software operacional tocando o “novo teste” botão no canto inferior esquerdo. Inserir dados do paciente ou um ID de amostra através da tela sensível ao toque. Para selecionar a amostra, primeiro escolha “ITI-cartucho” na lista suspensa, em seguida, “ortopedia” ao modo de aplicação e finalmente selecione “líquido sinovial” ou “fluido sonication” como tipo de amostra. Pressione o botão Iniciar. Digitalize o código de barras na parte inferior do tubo de amostra. Insira o tubo de amostra a lysator.Nota: O processo de Lise iniciará automaticamente e leva cerca de 30 min para terminar. Contagem regressiva do timer na tela lysator indicará quando a Lise é terminado. Selecione a amostra na tela para destravar o tubo de amostra de lysator a cabine. Retire o tubo de amostra do lysator e feche a tampa superior do lysator. Transferi o tubo de amostra na ranhura do tubo de amostra do cartucho do PCR. Insira o tubo de mastermix descongelada no slot do cartucho PCR mastermix. Siga as instruções no monitor da cabine, o cartucho PCR com tubo mastermix e amostra de digitalização. Insira o cartucho de PCR no slot de cartucho indicado do analisador. Quando terminar, o analisador libera o cartucho.Nota: As condições PCR são predefinidas pelo construtor e não podem ser alteradas pelo usuário. Para mais informações, consulte Guia de aplicação do fabricante. O processo PCR iniciará automaticamente e leva aproximadamente 4 h 10 min. Remova e descarte o cartucho. Na tela sensível ao toque de cabine, escolha “testes atuais” no canto inferior esquerdo e, em seguida, escolha o ID de amostra correta para exibir os resultados de teste. Salvar os resultados na memória da máquina e imprimir ou exportar (via unidade USB) para uma referência mais adicional.Nota: Informar o resultado da PCR, incluindo a identificação do patógeno e detecção de marcadores de resistência, o cirurgião sem demora. Um painel com 114 alvos de Ácido desoxirribonucleico (DNA) de patógenos bacterianos e fúngicos normalmente encontrados em infecções de implante e infecções de tecidos moles, juntamente com os marcadores de resistência aos antibióticos mais comuns são analisados. 3. cirúrgico: Coleta intraoperatória Nota: A cirurgia de artroplastia de revisão requer um especialista em nível de habilidade e experiência; para uma visão abrangente dos procedimentos cirúrgicos, por favor consulte livros didáticos18 do cirurgião. Uma descrição completa e detalhada do procedimento cirúrgico seria bem além do escopo deste artigo. Aqui o foco é sobre os detalhes da coleta de amostra e análise prévia. Na cirurgia de artroplastia de revisão, abster-se da administração de uma profilaxia antibiótica tiro única, para não comprometer os resultados das amostras microbiológicas obtidas durante a cirurgia. Aderindo a essa regra é recomendado, embora esta prática é controversa19,20. Use a abordagem cirúrgica existente na articulação, sempre que possível. As abordagens cirúrgicas adicionais irão comprometer os tecidos moles e aumentar a formação de cicatriz. Disse o tecido até a cápsula articular é bem exposta. Executar a artrotomia com uma seringa em riste, tão mais sinovial pode ser coletado para a seringa estéril para posterior análise, como dito acima (passos 1.7.1-1.7.3).Nota: Sem fluidos anti-séptico de lavagem devem ser utilizados até o implante é removido e tenham sido colhidas amostras de tecido. Remova os implantes comuns. Imediatamente após a remoção, transferi as peças de implante em um recipiente plástico estéril com uma tampa estanque e água.Nota: Instruções detalhadas para a remoção do implante podem ser encontradas na literatura livros didático (joelho, por exemplo: Wirtz et al, 16.4 do capítulo21; Quadril, por exemplo: Claes et al, capítulo 14.5.122). Instrumentos específicos podem ser necessários, como afirmado pelas instruções dos fabricantes. A técnica de remoção do implante varia consideravelmente entre implante de diferentes tipos e métodos de fixação. Um conjunto de formões e brocas, um martelo deslizante e um conjunto de remoção de prego intramedular universal são úteis na remoção de implantes ósseos de integrada23,24. Use uma cureta afiada estéril, fórceps e rongeur para remover o tecido da membrana através da interface osso-implante. Transferi uma amostra representativa do tecido em um recipiente plástico estéril com uma tampa de rosca, como amostras para Microbiologia e histologia.Nota: Um alargador pode ser usado para limpar o canal medular de todos os tecidos moles. Além disso, leve tecido sinovial e articulares cápsula amostras para exame e armazená-los em recipientes esterilizados. Pelo menos quatro espécimes no total devem ser reunidos. Envie todas as amostras e explantadas peças para o laboratório de microbiologia instantaneamente.Nota: Os antibióticos então podem ser dada. A escolha dos antibióticos corretos é essencial e deve ser uma decisão individualizada25,26. Conceitos terapêuticos devem ser decididos por um painel interdisciplinar dos cirurgiões e microbiologistas antecipadamente. Completar o desbridamento de local do implante anterior, removendo qualquer tecido que mostra sinais de detritos (tais como o desgaste do polietileno, metal ou as partículas de cimento) ou infecção e necrose (tecidos purulentos, avasculares, fibrina-revestido, membranosas ou “lamacento”). Remova qualquer osso morto ou osteitic. Remova todos os materiais estranhos tais como parafusos, fios, cerclages, os restos de cimento ósseo ou suturas não-absorvíveis (ver Claes et al, capítulo 14.5.322). Irriga o local cirúrgico utilizando um desinfectante de ferida de escolha, utilizando uma seringa de 50 mL. Irriga com quantidades amplas (pelo menos 3 L) de solução de ringer com um sistema de lavagem pulsada. Um espaçador pode ser necessário para estabilizar a articulação27. Feche a ferida usando revestimento antimicrobiano Suturas absorvíveis profundas para a cápsula ou fáscia (Poliglactina trançada suturas, revestidos com triclosan USP 2) e o tecido subcutâneo (Poliglactina trançada suturas, revestidos com triclosan USP 0). Feche a pele usando suturas interrompidas não-resorbing (monofilic polipropileno, USP 0 ou USP 2-0). 4. sonication Nota: Tenha cuidado ao trabalho estritamente assepticamente. Use um banco de segurança biológica classe II com fluxo de ar laminar para processamento do material explantado. Abra o recipiente plástico segurando a prótese explantada da sala de operação (ver passo 3.2) em um banco de trabalho do fluxo laminar de ar e adicionar a solução de cloreto de sódio 0,9% estéril até que o corpo estranho explantado coberto pelo menos 80% (cerca de 500-800 mL). Feche o recipiente de plástico. Agitar cuidadosamente ou agite o recipiente plástico usando um misturador do vortex em alta intensidade por 30 s. o recipiente plástico em transferência do banho sonication. Verificar o nível do líquido no banho sonication.Nota: O nível de líquido de banho sonication deve ser o mesmo que dentro do recipiente de plástico. Certifique-se que o recipiente plástico não pode ser inundado e se necessário adiciona ou retirar líquido do banho sonication. Proceda à sonicação a amostra por 5 min com uma frequência de 40 ± 2 kHz e poder densidade 0,22 ± 0,04 W/cm2. Shake ou vórtice o espécime completamente por 30 s.Nota: Vezes Sonication entre 1-5 min são os melhores para a dissolução de biofilmes, sem qualquer influência na viabilidade bacteriana28. Dentro do banco do fluxo laminar, coletar 50 mL do líquido de sonication e transferi-lo para um tubo estéril, hermeticamente fechado. Para criar um fluido concentrado sonication, centrifugar o tubo durante 10 minutos a 4.200 g. x, deixando um volume residual de 10 mL, descartar o sobrenadante restante com uma pipeta. Resuspenda o pellet por pipetagem e num Vortex. Semear em meios de cultura adequados (por exemplo, ágar sangue, ágar chocolate, ágar Sabouraud, agar do Schaedler, agar kanamicina-vancomicina ou caldo de tioglicolato) com 0,5 mL de fluido concentrado sonication cada. Inocular o frasco de cultura de sangue pediátrica com 2 mL, conforme descrito acima (consulte a etapa 1.7.1). Transferi 1 mL de fluido sonication concentrado em um tubo de coleta de sangue sem aditivos para análise PCR. Transfira o meio de cultura inoculado para a incubadora (35 ° C, 5% CO2). Incubar as culturas por 14 dias e verificar se há crescimento diariamente. Após 14 dias, descarte as culturas sem crescimento e relatório como negativo. Se o crescimento for detectado, proceder a identificação do patógeno usando técnicas padrão de identificação e testes de susceptibilidade. Relatar o resultado para o cirurgião sem demora.Nota: Aqui, identificação de patógenos foi realizada usando Matrix-assisted LASER desorbtion/ionização – time da espectroscopia de voo (MALDI-TOF). Testes de susceptibilidade antimicrobiana foi realizada com um analisador semiautomated29,30,31.

Representative Results

Presença de um PJI, conforme definido na reunião de consenso da sociedade a infecção músculo-esqueléticas (MSIS), considerou-se provado quando um critério principal, ou pelo menos três dos cinco critérios menores estavam presente. Principais critérios incluem a presença de uma fístula ou detecção de um patógeno em duas amostras separadas e microbiológicas. Critérios menores incluem a contagem de células positivas (> 3.000 leucócitos / µ l) ou diferenciação celular positivo (> 85% de granulócitos neutrófilos) em comum aspirado, amostras de taxa positiva de CRP e sedimentação em sangue, histologia positiva nas amostras de tecido ou deteção de um patógeno em apenas uma amostra microbiológicos19. Sensibilidade e especificidade foram calculados para teste de amplificação de ácidos nucleicos (NAT), em comparação com o padrão de ouro MSIS. Detalhes de paciente, incluindo patógenos detectados, são dadas na tabela 1. Nossos resultados mostraram uma sensibilidade moderada para PCR diagnóstico de fluido sonication e aspirado conjunto (50,0% e 55,6%) mas uma forte especificidade de 100. Sempre que diagnóstico PCR (n total = 62 testes) mostrou a existência na aspiração comum (n = 31) ou o fluido sonication (n = 31), o mesmo patógeno foi detectado mais tarde em uma das culturas microbiológicas convencionais. O PCR das amostras diferentes de casos de infecção não mostrou nenhum falso positivo resultado (ver Figura 1). O diagnóstico de PCR não conseguiu detectar alguns patógenos que foram comprovados com métodos convencionais de cultura microbiológica. 6 de 16 (37,0%) verdadeiros patógenos nas amostras de fluido de sonication e 5 de 13 (38,0%) patógenos da cultura comum fluido foram falta por detecção de PCR. Principalmente, o diagnóstico PCR perdeu a deteção de estafilococos coagulase-negativa (8 de 11). O diagnóstico PCR combinado de ambos os materiais (sinovial aspirado e sonication, “pool PCR”) identificado 12 de 18 casos de infecção corretamente (sensibilidade 66,7%, 95% CI: 41.0% 86,7%, ver tabela 2). Figura 1: Resultados de Resumo de NAT. O gráfico mostra os resultados resumidos a partir das amostras colectivas. Do lado direito é o grupo de pacientes que correspondem critérios de PJI, do lado esquerdo é o grupo que não o fez. As barras representam os métodos de amplificação de ácidos nucleicos. Falsos positivos e falsos negativos são mostrados em vermelho como percentagem do total. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Articulação Causa da revisão Critérios MSIS de fósforos? Tratamento antibiótico anterior? Cultura de fluido sonication Cultura de aspirado conjunta Cultura de sonication NAT Aspirado conjunto de NAT Quadril afrouxamento asséptico Não Não Joelho afrouxamento asséptico Não Não Staphlococcusepidermidis Joelho afrouxamento asséptico Não Não Dermabacterhominis Joelho afrouxamento asséptico Não Não Joelho afrouxamento asséptico Não Não Leifsoniaaquatica Quadril afrouxamento asséptico Não Não Joelho afrouxamento asséptico Não Não Joelho instabilidade Não Não Quadril luxação crônica Não Não Staphylococcushaemolyticus Joelho afrouxamento asséptico Não Não Quadril afrouxamento asséptico Não Não Quadril afrouxamento asséptico Não Não Staphlococcusepidermidis Joelho instabilidade Não Não Joelho infecção aguda Sim Sim Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonasaeruginosa Joelho infecção aguda Sim Não EscherichiaColi EscherichiaColi EscherichiaColi Quadril infecção crônica Sim Não Corynebakteriumspp. Staphlococcusepidermidis Joelho infecção aguda Sim Não Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcusaureus Joelho infecção crônica Sim Não Streptococcusagalacticae Streptococcusagalacticae Streptococcusagalacticae Streptococcusagalacticae Quadril infecção crônica Sim Sim Staphylococcus aureus Joelho infecção crônica Sim Não Staphlococcusepidermidis Joelho infecção crônica Sim Sim Staphlococcuepidermidis Staphlococcusepidermidis Quadril infecção crônica Sim Não Staphlococcusepidermidis Staphlococcusepidermidis Joelho infecção crônica Sim Não Staphlococcusepidermidis Estafilococos coagulase-negativaEstafilococos Estafilococos coagulase-negativaEstafilococos Quadril infecção crônica Sim Não Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Joelho infecção aguda Sim Não Staphlococcusepidermidis Staphlococcusepidermidis Estafilococos coagulase-negativaEstafilococos Estafilococos coagulase-negativaEstafilococos Quadril infecção aguda Sim Não Staphlococcusepidermidis Estafilococos coagulase-negativaEstafilococos Quadril infecção crônica Sim Não Staphlococcusepidermidis Staphlococcusepidermidis Quadril infecção aguda Sim Não Staphlococcusepidermidis Estafilococos coagulase-negativaEstafilococos Joelho infecção crônica Sim Não Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcusaureus Quadril infecção crônica Sim Não Enterococusfaecialis Enterococusfaecialis Enterococusspp. Enterococusspp. Joelho infecção crônica Sim Sim Enterocuccusfaecalis Enterocuccusfaecalis Enterococusspp. Enterococusspp. Tabela 1: pacientes detalhes e patógenos detectados. Resultados tabulares dos detalhes do pacientes, incluindo a causa da cirurgia de revisão, os critérios MSIS correspondentes e os patógenos detectados em microbiologia convencional e análise NAAT. Critérios Proceda à sonicação PCR Aspirado de PCR PCR em pool Valor de P 0.0036 0.0013 0,0001 Sensibilidade 50,0% 55,6% 66,7% Especificidade 100,0% 100,0% 100,0% Valor preditivo positivo 100,0% 100,0% 100,0% Valor preditivo negativo 59,1% 61,9% 68,4% Tabela 2: resultados de métodos microbiológicos. Tabulares resultados da avaliação do PCR diagnóstico de fluido sonication, aspirado conjunto e PCR em pool. N = 31 amostras de aspirado e sonication, respectivamente, n = 62 para os dados PCR em pool.

Discussion

Infecção do corpo estranho é um problema emergente em Ortopedia e cirurgia de trauma com tratamento dispendioso, longa hospitalização e deficiência funcional das articulações afetadas. O diagnóstico diferencial é um desafio. Muitos pesquisadores e clínicos estão dando atenção a este tópico, se esforçando para encontrar mais precisos e confiáveis métodos para diagnosticar o corpo estranho infecções. Até à data, muitos diferentes ferramentas de diagnóstico estão sendo avaliadas e implementadas no caminho diagnóstico32.

O procedimento de sonication é um método de valor inestimável, mostrando uma melhor sensibilidade do que culturas convencionais de tecido espécimes6. Em nosso estudo, nós mostramos que o fluido culturas sonication têm uma sensibilidade de 88.9%, com uma especificidade de 61,5%. Culturas convencionais de amostras de tecido e aspirados conjuntos, ambos tinham uma sensibilidade de 66,7%, com uma especificidade de 82,3% e 84,6%, respectivamente. Outros pesquisadores mostram resultados semelhantes para esses procedimentos microbiológicos convencionais6,33,34,35. Critica-se muitas vezes que o procedimento de sonication é propenso à contaminação, portanto deve ter especial cuidado no manuseio das amostras.

A possibilidade de detecção de DNA de um patógeno causador em amostras de tecidos ou fluidos é intrigante. NAT é um processo rápido que pode entregar os resultados dentro de algumas horas, em comparação com os métodos de cultura microbiológica demorada. Sem dúvida, NAT tem uma boa sensibilidade na detecção de agentes patogénicos, mas segurar o risco de detecção de contaminantes, assim, falta especificidade36. O grande benefício dessa técnica de PCR no diagnóstico de PJI foi documentado principalmente em pacientes que receberam terapia antibiótica perto de cirurgia ou por um longo período7,8. Estudos sugerem que a NAT do fluido sonication pode aumentar ainda mais a sensibilidade e especificidade37. Infelizmente, esta técnica não é rotineiramente disponível em laboratórios, devido ao seu fluxo de trabalho demorado.

Há certas limitações para a técnica PCR em geral: NAT detecta DNA com nenhuma diferenciação entre bactérias viáveis e não viáveis, dificultando a interpretação dos resultados. Vasta gama PCR só detectará ribosomal 16S o ácido ribonucleico (16S rRNA), não diferenciar entre patógenos37. Sistemas mais específicos não rotineiramente detectar marcadores de resistência aos antibióticos gene codificado. Uma antibiótica terapia-alvo, portanto, pode ser limitada sem testes de susceptibilidade suplementares.

O sistema aplicado neste estudo supera algumas destas limitações, a diferenciação entre bactérias específicas e identificar marcadores de resistência gene codificado. Em geral, os ensaios NAT podem ser considerados como uma complementação rápida e útil para confirmar PJI7,8,9,38.

É necessário planejar com antecedência na aspiração comum e na cirurgia: recipientes de amostra devem ser esterilizado e pronto, e transporte de amostra prompt deve estar disponível. Cirurgiões devem informar as microbiologistas em procedimentos planejados e que material a esperar de amostra. Quando realizar a aspiração comum, condições estritamente estéril deve ser assegurada, para prevenir a infecção iatrogênica da articulação. Em pacientes com tecido adiposos, punção conjunta pode ser desafiador e orientação fluoroscópica pode ser útil. Cirurgia de artroplastia de revisão requer um alto nível de especialização e só deve ser realizada por um cirurgião experiente. Explantados material não deve ser mantido na sala de cirurgia por mais tempo do que o necessário, mas ser enviado para a microbiologista logo que possível. Uma parte muito crítica no âmbito do presente protocolo é o risco potencial de contaminação. Não só durante a coleta de amostras, mas também quando manusear as amostras no laboratório de microbiologia, todo o pessoal envolvido (ortopedista, enfermeiras, técnicos, microbiólogos) deve trabalhar rapidamente e com precisão e ter formação adequada nos procedimentos.

Sonication e NAT são ferramentas valiosas no diagnóstico de infecções associadas a implantes. No entanto, os resultados devem sempre ser questionados cuidadosamente. Recomenda-se a discutir os resultados em uma discussão de mesa redonda de cirurgiões ortopédicos, microbiologistas e especialistas em doenças infecciosas e patologistas para chegar a acordo sobre a estratégia terapêutica individualizada.

Para implementar essa técnica no diagnóstico caminho de PJI pode ter várias vantagens. É um diagnóstico rápido com resultado dentro de horas. Devido a análise de vários marcadores de resistência de gene codificado, uma antibiótica terapia-alvo pode ocorrer em uma fase muito precoce no curso clínico. Como um efeito colateral, antibióticos de largo-escala podem ser salvos para as indicações de onde realmente são necessários. Outros tipos de amostra (por exemplo, amostras de tecido, cotonetes, hematoma, etc.) também podem ser investigados de acordo com o nosso protocolo. Desde que o cartucho PCR é um sistema fechado, nenhuma solução de problemas é necessário ou possível do lado do usuário. Qualquer adaptação do protocolo deve ser implementada pelo fabricante. Alterações no software e hardware (cartucho) continuamente são feitas pelo fabricante para melhorar o sistema, porém sem detalhes são tornadas públicas sobre as mudanças exatas em versões mais recentes.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de agradecer Curetis GmbH para apoiar este estudo.

Materials

sterile plastic container  Lock & Lock, Distributor ISI GmbH, Solingen, Germany EAN 8803733184403 Transport container for implants
Bactosonic 14.2  Bactosonic, Bandelin, Berlin, Germany 3290 "Sonication machine"
50ml Falcon tubes Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 352070 Centrifugation
PEDS medium blood culture flasks  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 442194 culture medium
Columbia agar with 5% sheep blood Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254071 culture medium
Mac Conkey agar Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254078 culture medium
chocolate agar  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254089 culture medium
sabouraud agar  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254096 culture medium
thioglycolate bouillon  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 221788 culture medium
Schaedler agar Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254084 culture medium
kanamycin/vancomycin agar Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254077 culture medium
Bactec FX blood culture system  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 441386/441385 culture medium
Unyvero A50 Analyzer Curetis, Holzgerlingen, Germany 60001 PCR machine
Unyvero L4 Lysator Curetis, Holzgerlingen, Germany 60002 PCR machine
Unyvero C8 Cockpit Curetis, Holzgerlingen, Germany 60003 PCR machine
Unyvero M1 Masterix Tube Curetis, Holzgerlingen, Germany 10002 consumables PCR
Unyvero i60 ITI Cartridge Curetis, Holzgerlingen, Germany 10040 consumables PCR
Unyvero Sample Tube Cap Curetis, Holzgerlingen, Germany 10004 consumables PCR
Unyvero Sample Tube Curetis, Holzgerlingen, Germany 10003 consumables PCR
S-Monovette 2.7ml Sarstedt AG, Nümbrecht, Germany 05.1729.001  Transport container (aspirate)
scalpel typ 11 pfm medical, Cologne, Germany 200130011 scalpel for stab incision
PP Container 70mL 55x45mm Sarstedt AG, Nümbrecht, Germany 759,922,721 Transport container (tissue specimen)
Vicryl Plus Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany VCP247H surgical suture material
Prolene 0 Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany EH7920H surgical suture material
Prolene 2/0 Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany EH7697H surgical suture material
Kodan  Tinktur forte farblos Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt, Germany 104005 alcoholic skin disinfectant
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Referências

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Hischebeth, G. T., Gravius, S., Buhr, J. K., Molitor, E., Wimmer, M. D., Hoerauf, A., Bekeredjian-Ding, I., Randau, T. M. Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (130), e55147, doi:10.3791/55147 (2017).
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