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Medicina

Diagnostica di romanzo in artroplastica di Revisione: sonicazione e reazione a catena multipla della polimerasi dell'impianto

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/55147
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1Institute of Medical Microbiology, Immunology and Parasitology,University Hospital Bonn, 2Department of Orthopaedics and Trauma Surgery,University Hospital Bonn, 3Division of EU Cooperation/Microbiology,Paul-Ehrlich-Institute

Summary

La diagnostica differenziale in arthroplasty doloroso è cruciale per il successo del trattamento. L’aspirazione unita è effettuata ordinariamente preoperatively. Reazione a catena multipla della polimerasi di aspirato congiunto e il fluido di sonicazione, uno strumento fattibile per il rilevamento rapido agente patogeno da questi campioni è descritto.

Abstract

Nei pazienti ortopedici, straniere associata al corpo infezioni, infezioni articolari soprattutto periprosthetic (PJIs), sono una complicazione devastante di arthroplasty. L’infezione richiede un trattamento complesso, può comportare costi notevoli lungo ricovero in ospedale e le cause. Revisioni chirurgiche multiple possono essere necessarie in questi pazienti, con una perdita in funzione così come nella qualità della vita.

La routine diagnostica preoperative include l’esame del sangue per proteina C – reattiva (CRP) e altri biomarcatori, nonché analisi congiunta aspirato per conteggio delle cellule, la differenziazione e la cultura. Intraoperative esemplari per istologia e microbiologia sono anche procedura standard. L’esame microbiologico di impianti rimossi con sonicazione, in combinazione con l’implementazione di tecniche di biologia molecolare in microbiologia, rappresentano due nuove tecniche attualmente impiegate per migliorare la diagnostica differenziale di PJI.

Presentiamo qui la procedura graduale di analisi congiunta aspirato e fluido di sonicazione, utilizzando un sistema di reazione a catena (PCR) basati su cartuccia multipla della polimerasi. Risultati sono stati confrontati con le colture convenzionali e criteri di consenso per PJI. Le colture microbiologiche convenzionali da biopsie dei tessuti, comune aspirato e fluido di sonicazione ha mostrato una sensibilità di 66,7%, 66,7% e 88,9%, rispettivamente e una specificità di 82,3%, 54,6% e 61,5%, rispettivamente. La PCR diagnostica del liquido sonicazione e il liquido sinoviale ha mostrato una sensibilità del 50,0% e 55,6%, rispettivamente e sia una specificità di 100.0%. Sia la diagnostica PCR combinata ha avuto una sensibilità di 66,7% e una specificità di 100.0%. La PCR multiplex rappresenta pertanto uno strumento diagnostico rapido con sensibilità moderata ma alta specificità nella diagnosi di PJI.

Introduction

Arthroplasties doloroso sono una sfida diagnostica in chirurgia ortopedica. Dopo mobilizzazione asettica, PJI è il secondo maggior motivo per fallimento dell’impianto e presenta una complicazione devastante dopo l’intervento di artroplastica. PJI è difficile da diagnosticare e difficile da trattare. Mancata diagnosi di un risultato probabile di volontà PJI nell’infezione ricorrente, con morbilità maggiore, perdita della funzione e la perdita della qualità di vita. Pertanto, infezione dovrebbe essere esclusa in tutti i pazienti che presentano con arthroplasty doloroso, prima vengono avviate misure terapeutiche.

Storia del paziente, esame clinico, l’esame del sangue per CRP e numero di globuli bianchi, così come radiografia o szintigraphy dell’articolazione colpita costituiscono la diagnostica di base1. La routine preoperatoria dovrebbe includere anche un’aspirazione comune in condizioni sterili, ove possibile. L’aspirato ha acquisito è un materiale molto prezioso nella ulteriore diagnostica.

Oltre al conteggio delle cellule e differenziazione cellulare in comune aspirato come analisi consolidata2, l’individuazione di biomarcatori di proteina può aiutare nella diagnostica differenziale3,4,5. Coltura microbiologica convenzionale resta il gold standard nel rilevamento del patogeno. Biofilm, causate da batteri Gram-positivi e Gram-negativi sia aderente alle superfici dell’impianto, sono un importante fattore patogeno in PJI. Pertanto, nel 2007, la procedura di sonicazione è stata implementata nel sistema diagnostico di stranieri associata al corpo infezioni in chirurgia ortopedica, interrompendo il biofilm su impianti rimossi per consentire il rilevamento del patogeno. I batteri sono quindi ripresi dalla loro forma che riposa alla forma attiva, rendendo l’individuazione nella cultura possibili. Sonicazione di impianti rimossi ha mostrato una sensibilità maggiore rispetto culture da tessuto esemplari (78,5% vs 60,8%)6.

Test di amplificazione degli acidi nucleici (NAT), come la PCR, si è recentemente trasferita nella portata dei clinici ed i microbiologi per diagnosticare PJI. Particolarmente in pazienti che hanno ricevuto terapia antibiotica prima dell’intervento, è stato indicato che la PCR diagnostica è utile nell’identificare gli organismi causativi7,8,9. Ultimamente, è stato introdotto un nuovo sistema multiplex PCR, appositamente progettato per infezioni dell’impianto e dei tessuti (ITI). Questo sistema basato su cartuccia offre una varietà di marcatori genomici per l’identificazione di agenti patogeni e marcatori di resistenza agli antibiotici. Tra la sua gamma di applicazione sono numerose indicazioni (infezioni protesiche articolari, infezioni del sito chirurgico, infezioni correlate a cardiology, infezioni catetere-associate, infezioni del piede diabetico, profonda della pelle e infezioni dei tessuti molli, impiantare infezioni, e ferita da ustione infezioni), e un ampio panel di materiale campione può essere utilizzato per questa tecnica (sonicazione liquido, liquido sinoviale, tamponi, tessuto, pus, aspirato/essudato e biofilm)10,11,12.

È il più grande vantaggio della procedura, rispetto ai convenzionale microbiologia, velocità: l’agente patogeno causativo possa essere identificato entro ore. Inoltre, questo sistema PCR rileva un ampio panel di marcatori di resistenza gene-codificati, permettendo l’inizio della terapia antibiotica mirata all’inizio. Con l’assistenza di PCR, i chirurghi possono essere in grado di distinguere tra pazienti infetti e non infetti in una fase molto precoce nella procedura diagnostica11. Qui, presentiamo il protocollo per eseguire questo multiplex PCR, diagnosticare rapidamente PJI da aspirato congiunta e fluido di sonicazione.

Protocol

Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale (046/09, Rev. 3). Consenso informato e informativa sulla privacy sono stati ottenuti da tutti i pazienti inclusi. 1. comune aspirazione Nota: La procedura deve essere eseguita in un teatro chirurgico o un intervento con condizioni asettiche comparabili. Assistenza da un infermiere o assistenza di medico è utile ma non obbligatorio. Posizionare il paziente in posizione supina su un letto di esame. Assicurarsi che il giunto di interesse sia privo di abbigliamento. Accorciare il corpo denso o lunghi capelli usando tagliatori elettrici. Non rimuovere i peli con un rasoio. Se l’articolazione dell’anca è quello di essere perforato, posizionare un fluoroscopio in direzione antero-posteriore. Se il ginocchio deve essere perforato, posizionare una bobina di ginocchio sotto al ginocchio del paziente, tale che il ginocchio si riposa in una posizione leggermente flessa13. Preparare un tavolo per strumenti con la seguente attrezzatura sterile: tamponi sterili, un telino fenestrato telo sterile, un bisturi sterile monouso, lama chirurgica appuntita (tipo #11) e siringa sterile da 10 mL con cannula sterile (20 gauge, 80 mm). Stabiliti separatamente disinfettante alcolico pelle, prelievo di sangue e un matraccio di cultura del sangue pediatrici. Vestito in un abito chirurgico, il cappuccio e la maschera e indossare guanti sterili. Lavare accuratamente la pelle del paziente presso il sito di puntura (p.e. superior recessus14 per l’area del portale anterolateral e del ginocchio per l’anca) con un disinfettante della pelle.Nota: Mente il tempo di esposizione necessario per il disinfettante usato (solitamente 90 s al ginocchio, 120 s all’anca per disinfettanti alcolici). Coprire il sito di puntura con un telo di copertura sterile fenestrato. Identificare il sito di puntura.Nota: Per il ginocchio, il sito corretto è 2 cm sopra il polo superiore della rotula e laterale di 2 cm al faccetta laterale. Per l’anca, trovare la spina dorsale iliaca superiore anteriore e spostare caudalmente fino a quando non è in linea con la sinfisi superiore. Assicurarsi che il sito sia laterale all’arteria femorale (circa 4 cm), che può sempre essere palpato15. Fare una piccola incisione attraverso la pelle (3-4 mm largo e profondo) con la lama del bisturi aguzzo presso il sito di puntura. Non applicare anestetici locali in quanto possono causare falsi negativi nella coltura microbiologica, dovuto il loro effetto batteriostatico. Collegare la cannula allo slip Luer della siringa. Inserire la cannula attraverso l’incisione lo stab. Al vano superiore dell’articolazione del ginocchio, mirare a un angolo di 45° dorsale e mediale, verso l’incavo sotto il polo superiore della rotula e inserire l’ago ad una profondità di circa 5 cm. aspirato il liquido articolare disegnando su pistone della siringa. Utilizzare informazioni aggiuntive fluoroscopio quando perforando un giunto di anca. Inserire l’ago nel sito di puntura, mirando medialmente ad un angolo di 60°. Nel fluoroscopio, assicurarsi che la punta dell’ago è puntata al collo di protesi. Fare avanzare la cannula ad una profondità di circa 8 cm (più profondo in pazienti adiposi) mentre ad aspirazione, fino a quando il liquido sinoviale è raggiunto. Tenere l’ago in posizione durante l’aspirazione, per evitare di raschiare la superficie della protesi.Nota: Contatto della punta dell’ago con la protesi garantisce un posizionamento intra-articolare. Di solito, non più di 5 mL di liquido può essere aspirato forma un giunto di anca, un giunto di ginocchio produrrà più di 10 mL. Dopo la rimozione della cannula, applicare una medicazione sterile per l’incisione. Per evitare la formazione di ematoma, applicare una benda alla gamba con leggera compressione. Trasferire l’aspirato congiunto raccolto nei contenitori del campione. Garantire sterili tecniche di lavorazione in tutto. Per inoculazione del matraccio di cultura del sangue pediatrici con il liquido aspirato congiunto, disinfettare la membrana del matraccio di cultura del sangue pediatrici con disinfettante alcolico. Mettere una cannula fresca sulla siringa e iniettare 1 a 3 mL di liquido aspirato congiunta il matraccio di cultura del sangue. Mescolare di agitazione o rotazione dolce16. Per la preparazione di un esemplare aspirato comune nativo, è necessario rimuovere la cannula dalla siringa. Aprire una provetta senza additivi e iniettare 1 mL di aspirato in questo tubo di raccolta. Riposizionare e fissare il coperchio per l’analisi di PCR.Nota: Spedire il campione al laboratorio di microbiologia senza indugio per l’analisi di PCR. Dallo stesso campione, colture microbiologiche convenzionali di aerobiche ed anaerobiche possono anche istituire17. Trasferimento da 1 a 4 mL di aspirato congiunto in una provetta contenente EDTA per conteggio e la differenziazione di cellula2. Spedire il campione ad un laboratorio di biochimica senza alcun ritardo. 2. PCR diagnostica Assicurarsi che tutti e tre i dispositivi (il lysator, l’analizzatore e il cockpit; Vedi la tabella materiali) sono installato e funzionante correttamente. Indicate tutte le forniture necessarie per l’esecuzione del test (la cartuccia PCR, un tubo di mix master, la provetta con il campione e cappuccio del tubo di campione, uno 0 – 200 micropipetta µ l e Puntali sterili) sul banco di lavoro. Scongelare il tubo mix master prima di iniziare la procedura, fissando a temperatura ambiente. Tutti i consumabili (provetta master mix, cartuccia e provetta) sono già prelabeled con un codice a barre. Rimuovere il tappo della provetta del campione. Prendere 180 µ l di campione raccolto (congiunta aspirato, vedere la sezione 1; o fluido di sonicazione, vedere la sezione 4) con una pipetta e trasferimento nel campione di tubo. Chiudere la provetta con il tappo del tubo di campione contenente proteine chinasi K e un gene di controllo interno per il controllo di qualità di tutto il workflow. Presso il cockpit, aprire il software operativo toccando il “nuovo test” pulsante in basso a sinistra. Immettere i dati del paziente o un ID campione tramite il touchscreen. Per selezionare il campione, prima scegli “ITI-cartuccia” dal menu a discesa, quindi “ortopedia” come modalità di applicazione e infine selezionare “liquido sinoviale” o “sonicazione fluido” come tipo di campione. Premere il pulsante start. Eseguire la scansione del codice a barre sul fondo della provetta del campione. Inserire la provetta con il campione del lysator.Nota: Il processo di lisi verrà avviato automaticamente e vorranno circa 30 minuti alla fine. Conto alla rovescia del timer sullo schermo lysator indicherà quando è terminata la lisi. Selezionare il campione sullo schermo di pozzetto per sbloccare la provetta con il campione dalla lysator. Rimuovere il tubo di campionamento dalla lysator e chiudere il coperchio superiore di lysator. Trasferimento nella provetta nello slot campione tubo della cartuccia PCR. Inserire il tubo di mastermix scongelati nello slot mastermix della cartuccia PCR. Seguire le istruzioni sul monitor del pozzetto, la cartuccia PCR con tubo mastermix e campione di scansione. Inserire la cartuccia PCR cartuccia indicata nello slot dell’analizzatore. Al termine dell’operazione, l’analizzatore rilascia la cartuccia.Nota: Le condizioni PCR sono preimpostate dal costruttore e non possono essere modificate dall’utente. Per ulteriori informazioni vedere Guida all’applicazione del produttore. Il processo PCR inizierà automaticamente e prendere circa 4 h e 10 min. Rimuovere e scartare la cartuccia. Il touchscreen di pozzetto, a scegliere “attuale test” in basso a sinistra, quindi scegliere l’ID corretto campione per visualizzare i risultati del test. Salvare i risultati sulla memoria della macchina e stampare o esportare (tramite drive USB) per ulteriore riferimento.Nota: Riportare il risultato della PCR, compreso l’identificazione dell’agente patogeno e individuazione di marcatori di resistenza, al chirurgo senza indugio. Un pannello con 114 acido deossiribonucleico (DNA) target di patogeni batterici e fungini trovato tipicamente in infezioni di protesi e infezioni dei tessuti molli, insieme con i marcatori di resistenza agli antibiotici più comuni sono analizzati. 3. intervento chirurgico: Intraoperative campionario Nota: Intervento di artroplastica di revisione richiede un livello di esperti di abilità e competenze; per una panoramica completa delle procedure chirurgiche, fare riferimento al libri di testo18 di chirurgo. Una descrizione completa e dettagliata della procedura chirurgica sarebbe ben oltre la portata di questo articolo. Qui il focus è sui dettagli della raccolta del campione e pre-analisi. Nell’intervento di artroplastica di revisione, astenersi dalla somministrazione di una profilassi antibiotica colpo singola, come non a compromettere i risultati dei campioni microbiologici ottenuti durante la chirurgia. Aderendo a questa regola è consigliato, anche se questa pratica è discutibile19,20. Utilizzare il metodo chirurgico esistente per il giunto quando possibile. Gli approcci chirurgici supplementari saranno danneggiare tessuti molli e aumentare la formazione della cicatrice. Sezionare il tessuto fino a quando la capsula articolare è ben esposta. Eseguire l’artrotomia con una siringa a portata di mano, così ulteriormente sinoviale possa essere raccolti nella siringa sterile per ulteriori analisi come indicato in precedenza (punti 1.7.1-1.7.3).Nota: Nessun fluidi di lavaggio antisettico devono essere utilizzati fino a quando l’impianto viene rimosso e sono stati prelevati campioni di tessuto. Rimuovere la protesi articolari. Immediatamente dopo la rimozione, è possibile trasferire le parti di impianto in un contenitore sterile di plastica con un coperchio a tenuta d’aria e acqua.Nota: Istruzioni dettagliate per la rimozione dell’impianto possono essere trovate nella letteratura libro libro di testo (ginocchio, per esempio: Wirtz et al., capitolo 16.421; Anca, per esempio: Claes et al., capitolo 14.5.122). Strumenti specifici possono essere necessari, come indicato dalle istruzioni dei costruttori. La tecnica di rimozione dell’impianto varia considerevolmente tra impianto diversi tipi e metodi di fissazione. Un set di scalpelli e punte, un martello scorrevole e un set di rimozione del chiodo intramidollare universale sono utile nella rimozione di impianti integrati ossuta23,24. Utilizzare un curette tagliente sterili, pinze e Pinza ossivora per rimuovere i tessuti a membrana dall’interfaccia osso-impianto. Trasferire un campione rappresentativo del tessuto in un contenitore sterile di plastica con coperchio a vite, come campioni per microbiologia e l’istologia.Nota: Un alesatore può essere utilizzato per cancellare il canale midollare di tutti i tessuti molli. Inoltre, prendere il tessuto sinoviale e capsula articolari campioni per esami e conservarli in contenitori sterili. Almeno quattro esemplari in totale devono essere raccolti. Inviare istantaneamente tutte le parti espiantati e i campioni al laboratorio di microbiologia.Nota: Gli antibiotici quindi possono essere dato. La scelta degli antibiotici corretti è essenziale e deve essere una decisione individuale25,26. Concetti terapeutici devono essere decisa da un gruppo interdisciplinare di chirurghi e microbiologi in anticipo. Completare lo sbrigliamento del sito implantare ex rimuovendo qualsiasi tessuto che mostra segni di detriti (ad esempio usura del polietilene, metallo o particelle di cemento) o infezione e necrosi (tessuti purulenti, avascolare, rivestite con fibrina, membranosi o “sludge metal”). Rimuovere qualsiasi osso morto o osteitic. Rimuovere tutti i materiali estranei come viti, fili, cerchiaggi, detriti di cemento osseo o suture non riassorbibili (vedi Claes et al., capitolo 14.5.322). Irrigare il sito chirurgico utilizzando un disinfettante di ferita di scelta utilizzando una siringa da 50 mL. Irrigare con abbondanti quantità (almeno 3 L) di soluzione di ringer con un sistema di lavaggio pulsato. Un distanziatore può essere necessario per stabilizzare il comune27. Chiudere la ferita usando rivestite con antimicrobico suture riassorbibili profonde per la capsula o la gronda (polyglactin intrecciato suture, rivestite con triclosan, USP 2) e il tessuto sottocutaneo (suture polyglactin intrecciato, rivestite con triclosan, USP 0). Chiudere la pelle usando i suturare interrotti non-resorbing (monofilic polipropilene, USP 0 o USP 2-0). 4. sonicazione Nota: Fare attenzione a lavorare strettamente asetticamente. Utilizzare una panchina di sicurezza biologica di classe II con flusso d’aria laminare per l’ulteriore elaborazione del materiale espiantato. Aprire il contenitore di plastica che tiene la protesi explanted dalla sala operatoria (Vedi punto 3.2) sotto un banco di lavoro di flusso d’aria laminare e aggiungere soluzione sterile di cloruro di sodio 0,9% fino a quando il corpo estraneo explanted è coperto almeno 80% (circa 500-800 mL). Chiudere il contenitore di plastica. Agitare accuratamente o agitare il contenitore di plastica usando un miscelatore vortex su ad alta intensità per 30 s. trasferimento del contenitore in plastica nel bagno di sonicazione. Controllare il livello del liquido nel bagno di sonicazione.Nota: Il livello del liquido bagno sonicazione deve essere lo stesso all’interno del contenitore di plastica. Assicurarsi che il contenitore di plastica non può essere allagato e se necessario, aggiunta o rimuovere il liquido dal bagno di sonicazione. Sonicare il campione per 5 minuti con una frequenza di 40 ± 2 kHz e potenza densità 0.22 ± 0,04 W/cm2. Frullato o vortice il campione accuratamente per 30 s.Nota: Tempi di sonicazione tra 1-5 min sono migliori per la dissoluzione del biofilm, senza alcuna influenza su vitalità batterica28. All’interno del banco di flusso laminare, raccogliere 50 mL del fluido sonicazione e trasferirlo in una provetta sterile, ermeticamente chiusi. Per creare un fluido concentrato sonicazione, centrifugare la provetta per 10 min a 4.200 g. x lasciando un volume residuo di 10 mL, scartare il surnatante con una pipetta rimanente. Risospendere il pellet di pipettaggio e Vortex. Inoculare idonei terreni di coltura (per esempio agar sangue, agar cioccolato, Sabouraud agar, agar di Schaedler, agar kanamicina-vancomicina o brodo tioglicolato) con 0,5 mL di sonicazione concentrato fluido ogni. Inoculare il matraccio di cultura del sangue pediatrici con 2 mL come descritto in precedenza (Vedi punto 1.7.1). Trasferire 1 mL di fluido concentrato sonicazione in una provetta senza additivi per l’analisi di PCR. Trasferire i terreni di coltura inoculato nell’incubatore (35 ° C, 5% CO2). Incubare le colture per 14 giorni e controllare la crescita ogni giorno. Dopo 14 giorni, scartare le culture senza crescita e relazione come negativo. Se viene rilevata la crescita, eseguire l’identificazione dell’agente patogeno utilizzando tecniche standard d’identificazione ed antibiogramma. Segnalare il risultato al chirurgo senza indugio.Nota: Qui, identificazione di patogeni è stato effettuato utilizzando Matrix-assisted LASER detezione/ionizzazione – time della spettroscopia di volo (MALDI-TOF). Test di suscettibilità antimicrobica è stata eseguita con un analizzatore semiautomatica29,30,31.

Representative Results

Presenza di un PJI, come definito dalla riunione di consenso di società l’infezione osteomuscolare (MSIS), è stata considerata provata quando un criteri maggiori o almeno tre su cinque criteri minori erano presenti. Criteri maggiori includono la presenza di una fistola o l’individuazione di un agente patogeno in due campioni microbiologici separati. Criteri minori comprendono il conteggio delle cellule positive (> 3.000 leucociti / µ l) o differenziazione delle cellule positive (> 85% granulociti neutrofili) in comune aspirato, tasso positivo di CRP e sedimentazione nel sangue campioni, l’istologia positiva in campioni di tessuto o rilevamento di un agente patogeno in un solo campione microbiologico19. Sensibilità e specificità sono state calcolate per test di amplificazione degli acidi nucleici (NAT), rispetto ai MSIS gold standard. Dati del paziente, compresi i patogeni rilevati, sono riportati nella tabella 1. Nostri risultati hanno mostrato una moderata sensibilità per la PCR diagnostica di sonicazione fluido e congiunta aspirato (50,0% e 55,6%) ma una specificità molto forte di 100. Ogni volta che PCR diagnostica (Totale n = 62 test) ha mostrato un risultato positivo in aspirato congiunto (n = 31) o il fluido di sonicazione (n = 31), l’agente patogeno stesso è stato rilevato più successivamente in una delle colture microbiologiche convenzionali. La PCR dei campioni differenti di casi di infezione non ha mostrati nessun falso positivo risultato (Vedi Figura 1). La PCR diagnostica non è riuscito a rilevare alcuni agenti patogeni che sono state dimostrate con metodi di coltura microbiologica convenzionale. agenti patogeni vero 6 su 16 (37,0%) in campioni di liquido di sonicazione e 5 su 13 (38,0%) patogeni dalla comune cultura fluido sono stati mancati tramite rilevazione di PCR. Principalmente, la diagnostica PCR mancato rilevamento di stafilococchi coagulasi-negativi (8 su 11). La diagnostica PCR combinata di entrambi i materiali (liquido articolare aspirato e sonicazione, “pool PCR”) identificato correttamente 12 su 18 casi di infezione (sensibilità 66,7%, 95% CI: 41,0% a 86,7%, Vedi tabella 2). Figura 1: Risultati di riepilogo di NAT. Il grafico mostra i risultati riassunti dei campioni collettivi. Sul lato destro è il gruppo di pazienti PJI coincidenti, sul lato sinistro è il gruppo che non ha fatto. Le barre rappresentano i metodi di amplificazione dell’acido nucleico. Falsi positivi e falsi negativi sono mostrati in rosso come percentuale del totale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Giunto Causa di Revisione Partite MSIS criteri? Precedente trattamento antibiotico? Coltura fluida sonicazione Cultura comune aspirato Cultura di sonicazione NAT Aspirato congiunta NAT Anca mobilizzazione asettica No No Al ginocchio mobilizzazione asettica No No Linfonodiepidermidis Al ginocchio mobilizzazione asettica No No Dermabacterhominis Al ginocchio mobilizzazione asettica No No Al ginocchio mobilizzazione asettica No No XyliAquatica Anca mobilizzazione asettica No No Al ginocchio mobilizzazione asettica No No Al ginocchio instabilità No No Anca lussazione cronica No No Stafilococcohaemolyticus Al ginocchio mobilizzazione asettica No No Anca mobilizzazione asettica No No Anca mobilizzazione asettica No No Linfonodiepidermidis Al ginocchio instabilità No No Al ginocchio infezione acuta Sì Sì Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonasaeruginosa Al ginocchio infezione acuta Sì No Escherichiacoli Escherichiacoli Escherichiacoli Anca infezione cronica Sì No Corynebakteriumspp. Linfonodiepidermidis Al ginocchio infezione acuta Sì No Stafilococco aureo Stafilococco aureo Stafilococco aureo Stafilococcoaureus Al ginocchio infezione cronica Sì No Streptococcoagalacticae Streptococcoagalacticae Streptococcoagalacticae Streptococcoagalacticae Anca infezione cronica Sì Sì Stafilococco aureo Al ginocchio infezione cronica Sì No Linfonodiepidermidis Al ginocchio infezione cronica Sì Sì Staphlococcuepidermidis Linfonodiepidermidis Anca infezione cronica Sì No Linfonodiepidermidis Linfonodiepidermidis Al ginocchio infezione cronica Sì No Linfonodiepidermidis Stafilococchi coagulasi-negativiStafilococchi Stafilococchi coagulasi-negativiStafilococchi Anca infezione cronica Sì No Stafilococco aureo Stafilococco aureo Al ginocchio infezione acuta Sì No Linfonodiepidermidis Linfonodiepidermidis Stafilococchi coagulasi-negativiStafilococchi Stafilococchi coagulasi-negativiStafilococchi Anca infezione acuta Sì No Linfonodiepidermidis Stafilococchi coagulasi-negativiStafilococchi Anca infezione cronica Sì No Linfonodiepidermidis Linfonodiepidermidis Anca infezione acuta Sì No Linfonodiepidermidis Stafilococchi coagulasi-negativiStafilococchi Al ginocchio infezione cronica Sì No Stafilococco aureo Stafilococco aureo Stafilococcoaureus Anca infezione cronica Sì No Enterococcusfaecialis Enterococcusfaecialis Enterococcusspp. Enterococcusspp. Al ginocchio infezione cronica Sì Sì Enterocuccusfaecalis Enterocuccusfaecalis Enterococcusspp. Enterococcusspp. Tabella 1: dati del paziente e agenti patogeni rilevati. Risultati tabulari dei dettagli pazienti, compresa la causa dell’intervento di revisione, i criteri MSIS corrispondenti e gli agenti patogeni rilevati in microbiologia convenzionale e analisi NAAT. Criteri PCR Sonicare Aspirato PCR PCR in pool Valore di P 0.0036 0,0013 0,0001 Sensibilità 50.0% 55,6% 66,7% Specificità 100.0% 100.0% 100.0% Valore predittivo positivo 100.0% 100.0% 100.0% Valore predittivo negativo 59,1% 61,9% 68,4% Tabella 2: risultati di metodi microbiologici. Tabulare risultati della valutazione della PCR diagnostica del fluido di sonicazione, congiunta aspirato e PCR in pool. N = 31 esemplare per aspirare e sonicazione, rispettivamente, n = 62 per i dati aggregati di PCR.

Discussion

Corpo estraneo l’infezione è un problema emergente in Ortopedia e traumatologia con trattamento costoso, lungo ricovero in ospedale e deficit funzionale delle articolazioni colpite. La diagnostica differenziale è impegnativa. Molti ricercatori e clinici stanno dando attenzione a questo argomento, cercando di trovare più precisi e metodi affidabili per la diagnosi di corpo estraneo infezioni nosocomiali. Fin qui, molti strumenti diagnostici diversi vengono attuate nella diagnostica percorso32.

La procedura di sonicazione è un metodo prezioso, che mostrano una sensibilità migliore rispetto le colture convenzionali da campioni di tessuto6. Nel nostro studio, abbiamo dimostrato che le colture del liquido sonicazione hanno una sensibilità di 88,9% con una specificità pari al 61,5%. Le colture convenzionali da campioni di tessuto e misto aspira entrambi ha avuto una sensibilità di 66,7% con una specificità di 82,3% e 84,6%, rispettivamente. Altri ricercatori mostrano risultati simili per queste procedure microbiologiche convenzionali6,33,34,35. Si è spesso criticato che procedura di sonicazione è incline alla contaminazione, quindi dovrà prestare particolare attenzione nella manipolazione dei campioni.

La possibilità di rilevare il DNA di un agente patogeno causativo in campioni di tessuto o liquidi è intrigante. NAT è una procedura rapida che può fornire risultati entro un paio d’ore, rispetto ad i metodi di coltura microbiologica che richiede tempo. Senza dubbio, NAT ha una buona sensibilità nel rilevare gli agenti patogeni, ma tenere il rischio di rilevare contaminanti, così carente di specificità36. Il grande vantaggio di questa tecnica PCR nella diagnosi di PJI è stato documentato soprattutto in pazienti che hanno ricevuto terapia antibiotica vicino alla chirurgia o per un più lungo periodo7,8. Gli studi suggeriscono che NAT del fluido di sonicazione può aumentare ulteriormente la sensibilità e specificità37. Purtroppo, questa tecnica non è normalmente disponibile nei laboratori, a causa del suo flusso di lavoro che richiede tempo.

Ci sono alcune limitazioni per la tecnica PCR in generale: NAT rileva DNA senza differenziazione tra batteri vitali e non vitali, rendendo difficile l’interpretazione dei risultati. Vasto-gamma PCR rileverà solo acido ribonucleico ribosomiale 16S (16S rRNA), non distinguendo tra agenti patogeni37. Più specifici sistemi ordinariamente non rilevare marcatori di resistenza antibiotica codificata dal gene. Una terapia antibiotica mirata può quindi essere limitata senza ulteriore test di suscettibilità.

Il sistema applicato in questo studio supera alcune di queste limitazioni, differenziando tra batteri specifici e identificazione di marcatori di resistenza gene-codificati. Nel complesso, saggi di NAT possono essere considerati come una complementazione veloce e utile per confermare PJI7,8,9,38.

È necessario pianificare in anticipo in aspirazione comune ed in chirurgia: contenitori per campioni devono essere sterile e pronto, e trasporto richiesta campione devono essere disponibile. I chirurghi dovrebbero breve loro microbiologi su previste procedure e cosa materiale aspettarsi campione. Quando eseguire l’aspirazione comune, condizioni rigorosamente sterile deve essere assicurata, per prevenire l’infezione iatrogenica del giunto. In pazienti adiposi, puntura congiunta può essere impegnativa e guida fluoroscopica può essere utile. Intervento di artroplastica di revisione richiede un altissimo livello di competenza e deve essere eseguita solo da un chirurgo esperto. Explanted materiale non dovrebbe essere tenuto nella sala operatoria più del necessario, ma essere inviato per il microbiologo appena possibile. Una parte molto critica all’interno di questo protocollo è il potenziale rischio di contaminazione. Non solo durante la raccolta dei campioni, ma anche durante la manipolazione dei campioni al laboratorio di microbiologia, tutto il personale coinvolto (chirurgo ortopedico, infermieri, tecnici, microbiologi) devono lavorare rapidamente e con precisione e avere una formazione adeguata nelle procedure.

Sonicazione e NAT sono strumenti importanti nella diagnosi di infezioni associate all’impianto. Tuttavia, i risultati dovrebbero essere interrogati sempre con attenzione. Si consiglia di discutere i risultati in una tavola rotonda di chirurghi ortopedici, microbiologi e specialisti in malattie infettive e patologi per concordare la strategia terapeutica individualizzata.

Per implementare questa tecnica della diagnostica percorso di PJI può avere diversi vantaggi. È una diagnosi rapida con un risultato entro ore. A causa l’analisi di diversi marcatori di resistenza gene codificato, una terapia antibiotica mirata può avvenire in una fase molto precoce nel decorso clinico. Come effetto collaterale, gli antibiotici di vasto-gamma possono essere salvati per le indicazioni di cui sono veramente necessari. Altri tipi di campioni (ad es. gli esemplari del tessuto, tamponi, ematoma, ecc.) possono anche essere studiati secondo il nostro protocollo. Poiché la cartuccia PCR è un sistema chiuso, non risoluzione dei problemi è necessario o possibile sul lato utente. Qualsiasi adattamento del protocollo deve essere implementata dal produttore. Cambiamenti nel software e hardware (cartuccia) sono continuamente fatti dal produttore per migliorare il sistema, tuttavia nessuna informazione sono resi pubblica nelle modifiche esatte nelle versioni più recenti.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori vorrei ringraziare Curetis GmbH per sostenere questo studio.

Materials

sterile plastic container  Lock & Lock, Distributor ISI GmbH, Solingen, Germany EAN 8803733184403 Transport container for implants
Bactosonic 14.2  Bactosonic, Bandelin, Berlin, Germany 3290 "Sonication machine"
50ml Falcon tubes Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 352070 Centrifugation
PEDS medium blood culture flasks  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 442194 culture medium
Columbia agar with 5% sheep blood Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254071 culture medium
Mac Conkey agar Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254078 culture medium
chocolate agar  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254089 culture medium
sabouraud agar  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254096 culture medium
thioglycolate bouillon  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 221788 culture medium
Schaedler agar Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254084 culture medium
kanamycin/vancomycin agar Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 254077 culture medium
Bactec FX blood culture system  Becton & Dickinson, Heidelberg, Germany 441386/441385 culture medium
Unyvero A50 Analyzer Curetis, Holzgerlingen, Germany 60001 PCR machine
Unyvero L4 Lysator Curetis, Holzgerlingen, Germany 60002 PCR machine
Unyvero C8 Cockpit Curetis, Holzgerlingen, Germany 60003 PCR machine
Unyvero M1 Masterix Tube Curetis, Holzgerlingen, Germany 10002 consumables PCR
Unyvero i60 ITI Cartridge Curetis, Holzgerlingen, Germany 10040 consumables PCR
Unyvero Sample Tube Cap Curetis, Holzgerlingen, Germany 10004 consumables PCR
Unyvero Sample Tube Curetis, Holzgerlingen, Germany 10003 consumables PCR
S-Monovette 2.7ml Sarstedt AG, Nümbrecht, Germany 05.1729.001  Transport container (aspirate)
scalpel typ 11 pfm medical, Cologne, Germany 200130011 scalpel for stab incision
PP Container 70mL 55x45mm Sarstedt AG, Nümbrecht, Germany 759,922,721 Transport container (tissue specimen)
Vicryl Plus Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany VCP247H surgical suture material
Prolene 0 Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany EH7920H surgical suture material
Prolene 2/0 Johnson&Johnson Medical GmbH, Ethicon Germany, Norderstedt, Germany EH7697H surgical suture material
Kodan  Tinktur forte farblos Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt, Germany 104005 alcoholic skin disinfectant
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Hischebeth, G. T., Gravius, S., Buhr, J. K., Molitor, E., Wimmer, M. D., Hoerauf, A., Bekeredjian-Ding, I., Randau, T. M. Novel Diagnostics in Revision Arthroplasty: Implant Sonication and Multiplex Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (130), e55147, doi:10.3791/55147 (2017).
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