Na diferenciação in vitro de miofibras maduras for Imaging ao vivo

NOTA: Um rato produz mioblastos suficientes para cerca de dois pratos de 35 mm ou dois pratos de geração de imagens ao vivo, então mattings plano, dissecção, e revestimento (passo 2.6) em conformidade. Desde mioblastos são isolados a partir de centrifugações sequenciais e preplating, o protocolo deve ser feito em lotes de 5 – 10 animais. Todos os procedimentos que envolvem indivíduos animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Instituto de Medicina Molecular e da Universidade Pierre et Marie Curie 1. Dissecção do Ratos Neonatal Músculos Hind-membros Preparar todas as soluções previamente (Tabela Materiais) e esterilizar por filtração (filtro de 0,22 nm). Certifique-se de todos os meios de comunicação estão a 37 ° C antes da adição às células, com excepção das formulações contendo matriz de membrana basal (por exemplo, Matrigel). Esterilizar o material de dissecção (um de cada: tesoura curva, tesoura reta, pinças regulares,e uma pinça de ponta fina) e bancada de trabalho, limpando-os com etanol 70%. Preparar um prato de 100 milímetros de Petri com 5 mL de fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS) para a recolha de músculo e mantê-lo em gelo até que o passo de trituração. Decapitar P6 – ratos P8 com tesoura reta e esterilizar a pele com etanol 70%. Faça uma incisão na pele para trás e puxe-o suavemente para os membros posteriores até que seja removido, expondo completamente a musculatura posterior-membro. Utilizar as pinças para remover o tecido de gordura, sem danificar os músculos. Para remover os músculos posteriores-membros dorsais, manter o membro alongado e dobrar a pata para expor os tendões do salto. Use as tesouras curvadas para músculo separado do osso, a partir dos tendões, deslizando suavemente e de corte para cima. Extirpar os músculos e colocá-los em DPBS gelado. Isolar os quadríceps, apertando o músculo com uma pinça de ponta fina e corte em torno dele sem danificar o fêmur ou a articulação do joelho. Após dissecação todos os animais, a uma capa de cultura de célula de fluxo laminar estéril, em que todos os passos que se seguem devem ser realizados. Isolamento 2. mioblasto Remover o excesso de DPBS. Picar o tecido com tesoura curva esterilizadas de modo a obter uma massa uniforme. Recolhe-se o tecido moído num tubo de centrífuga cónico de 50 ml com 5 ml de mistura de digestão e incubar-a com agitação a 37 ° C durante 90 min. Parar a digestão através da adição de 6 ml de meio de dissecção e centrifugar a suspensão durante 5 minutos a 75 xg para sedimentar as restante tecido. Recolher cuidadosamente o sobrenadante. Certifique-se de não recolher os restos de tecido. Centrifugar-lo a 350 xg durante 5 min; ressuspender-o em 5 mL de meio de dissecção. Filtra-se a suspensão de células através de um coador de células de 40 ^ m. Adicionar 25 mL de meio de dissecção e preplate-lo em um prato de 150 mm para os 4 h numa incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO 2 </ Sub>) para permitir que os fibroblastos para aderir. Enquanto preplating, pratos de revestimento com 500 mL de matriz de membrana basal diluído 1: 100 em IMDM a frio durante 1 h, à RT. Lavar uma vez com DPBS e placa as células imediatamente (passo 2.8) ou deixar com meio de crescimento até o chapeamento. Após preplating, recolher o sobrenadante e centrifuga-se que a 350 xg durante 10 min. Ressuspender-lo no meio de crescimento e contar as células em um hemocitómetro. Ajustar o volume para que entre 150.000 e 250.000 células são banhados por membrana basal prato revestido de matriz. Manter as células numa incubadora de cultura de células. 3. Diferenciação de miofibras NOTA: Depois de 3 d, as células devem começar a fundir e formar miotubos em cerca de 70% de confluência (Figura 1B). Neste ponto, transfectar as células, se desejado, com um siRNA ou de ADN de interesse. Se as células não estão a ser transfectada, mudar directamente para meio de diferenciação e de esquip para o passo 3.4. Transfectar com reagentes de transfecção seguindo as instruções do fabricante. Incubam-se as células durante 5 h com complexos de siRNA-lípido (20 nM + 1 ul de reagente) ou complexos ADN-lípido (1 ug + 1 uL de reagente). Otimizar as concentrações de siRNA e de DNA, se necessário. Lavá-los uma vez com meio de diferenciação e, em seguida, mudar para o novo meio de diferenciação. No dia seguinte, dilui-se a matriz de membrana basal 1: 2 em meio de diferenciação gelada. Remover o meio e adicionar 200 existente ul de matriz arrefecido com gelo para cada prato. Incubar durante 30 min numa incubadora de cultura de células. Suplementar o meio de diferenciação com agrina (100 ng / mL) e adicionar cuidadosamente 2 mL para as células. Cuidadosamente mudar metade do meio a cada 2 d, sempre que completa com agrina a uma concentração final de 100 ng / mL. Monitorar diferenciação celular e viabilidade. Dependendo de uma variedade de factores tais como (FBS e Chicken extracto de embrião origens), as células podem ter entre 5-10 diferenciação d para atingir plena maturação (Figura 2). 4. A imunocoloração em pratos de vidro de fundo Para a imunocoloração, em qualquer ponto de tempo de interesse, lavagem das células uma vez com DPBS e corrigi-los com PFA a 4%, à TA, durante 10 min. Lave-os duas vezes com DPBS. Neste ponto, as células podem ser armazenadas a 4 ° C. Permeabilizar-os com 0,5% de Triton X-100 durante 5 min à TA. Lavar duas vezes com PBS e bloquear com solução de bloqueio durante 30 minutos à TA. Incubar os com anticorpo primário diluído em solução bloqueadora O / N a 4 ° C. Lavar 3x com DPBS durante 5 min à TA. Incubar-los com o anticorpo secundário e 0,2 ug / ml de DAPI, durante 1 h, à RT. Lavar 3x com DPBS durante 5 min à TA. Adicionar 200 mL de meio de montagem e proceder à imagem.