In vitro Differenzierung von Mature Muskelfasern für Live - Imaging

HINWEIS: Eine Maus Erträge ausreichend Myoblasten für etwa zwei 35-mm-Schalen oder zwei Live-Imaging-Gerichte, so Plan Mattierungen, Dissektion und Beschichtung (Schritt 2.6) entsprechend. 10 Tiere – Da Myoblasten durch sequentielle Zentrifugationen und Vorabscheidungs ​​isoliert werden, sollte das Protokoll in Chargen von 5 erfolgen. Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden wurden von der Tierethikkommission im Instituto de Medicina Molecular und Universität Pierre et Marie Curie genehmigt 1. Dissection von neugeborenen Mäusen Hind Gliedmaßen Muskeln Bereiten Sie alle Lösungen im Voraus (Werkstoff – Tabelle) und sterilisieren durch Filtration (0,22 & mgr; m – Filter). Sicherstellen , dass alle Medien , auf 37 ° C werden vor der Zugabe zu den Zellen, mit Ausnahme der Formulierungen Basalmembran – Matrix , die (beispielsweise Matrigel). Sterilisieren Sie die Dissektion Material (je eine aus: gebogene Schere, gerade Schere, regelmäßige Zange,und Feinspitze Zange) und die Werkbank, indem sie mit 70% Ethanol abwischen. Bereiten Sie eine 100 mm Petrischale mit 5 ml Dulbecco-Phosphat-gepufferte Saline (DPBS) für das Muskel Sammlung und halten Sie sie auf Eis, bis die Zerkleinerungs- Schritt. Enthaupten P6 – P8 Mäuse mit geraden Schere und sterilisieren Sie die Haut mit 70% Ethanol. Einen Einschnitt in der Rückseite der Haut und ziehen Sie sie vorsichtig auf die Hinterbeine, bis sie entfernt wird, vollständig die Hinterschenkel-Muskulatur auszusetzen. Verwenden Sie die Zange Fettgewebe zu entfernen, ohne die Muskeln zu beschädigen. Um die Rückenhinterbeinmuskeln zu entfernen, halten Sie das Bein gestreckt und biegen Sie die Pfote an der Ferse Sehnen aus. Verwenden Sie die gebogene Schere zum Trennen von Muskel von Knochen, von den Sehnen beginnen, durch sanftes Gleiten und Schneiden nach oben. Excise die Muskeln und sie in gefrorener DPBS. Isolieren Sie die Quadrizeps durch den Muskel mit Feinspitze Zange kneifen und schneiden um es ohne den Oberschenkelknochen oder das Kniegelenk zu beschädigen. Nachdem alle Tiere seziert, gehen Sie sollten in einen sterilen Laminar-Flow-Zellkultur-Haube, wenn alle folgenden Schritte durchgeführt werden. 2. Myoblasten Isolation Entfernen Sie den Überschuss an DPBS. Mince das Gewebe mit sterilisiertem gebogene Schere, um eine einheitliche Masse zu erhalten. Sammeln das zerkleinerte Gewebe in einer 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen unter Verwendung von 5 ml Verdauungsmischung und Inkubieren sie unter Rühren bei 37 ° C für 90 min. Stoppen Sie die Verdauung durch Zugabe von 6 ml Dissektion Medium und Zentrifugieren Sie die Suspension für 5 min bei 75 xg das verbleibende Gewebe zu pelletieren. sammeln vorsichtig den Überstand. Achten Sie darauf, nicht Gewebedebris sammeln. Zentrifugieren es bei 350 xg für 5 min; Resuspendieren in 5 ml Dissektion Medium. Filtern Sie die Zellsuspension durch ein 40 & mgr; m Zelle Sieb. 25 ml Dissektion Medium und Vorbeschichtungszyklus sie in einem 150 – mm – Schale für 4 h in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C und 5% CO 2 </ Sub>) die Fibroblasten zu ermöglichen, zu haften. Während Vorplattieren mantel Gerichte mit 500 & mgr; l Basalmembranmatrix 1: 100 verdünnt in kaltem IMDM für 1 h bei RT. Waschen Sie einmal mit DPBS und die Zellen Platte sofort (Schritt 2.8) oder verlassen mit Wachstumsmedium bis Plattierung. Nach Vorplattieren, sammeln Sie den Überstand und Zentrifuge für 10 min bei 350 x g. Resuspendieren sie in einem Wachstumsmedium und zählen Sie die Zellen auf einem Hämozytometer. Stellen Sie die Lautstärke so, dass zwischen 150.000 und 250.000 Zellen pro Basalmembranmatrix beschichtete Schale ausgestrichen werden. Halten Sie die Zellen in einer Zellkultur-Inkubator. 3. myofiber Differenzierung HINWEIS: Nach 3 d, sollten die Zellen zu Sicherung und Form Myotuben bei etwa 70% Konfluenz (Abbildung 1B) beginnen. An diesem Punkt, um die Zellen zu transfizieren, falls gewünscht, mit einer siRNA oder DNA von Interesse. Wenn die Zellen nicht transfiziert werden, ändern Sie direkt an Differenzierungsmedium und Skip zu Schritt 3.4. Transfizieren mit Transfektionsreagenzien den Anweisungen des Herstellers folgen. Inkubiere die Zellen für 5 h mit siRNA-Lipid-Komplexe (20 nM + 1 & mgr; l Reagenz) oder DNA-Lipid-Komplexe (1 & mgr; g + 1 & mgr; l Reagenz). Optimieren Sie die siRNA und DNA-Konzentrationen, wenn nötig. Waschen Sie sie einmal mit Differenzierungsmedium und wechseln Sie dann auf neue Differenzierungsmedium. Am folgenden Tag, verdünnen Sie die Basalmembranmatrix 1: 2 in eiskaltem Differenzierungsmedium. Entfernen Sie das vorhandene Medium und mit 200 & mgr; l eiskaltem Matrix zu jedem Gericht. Inkubieren für 30 min in einem Zellkulturbrutschrank. Ergänzen Sie die Differenzierungsmedium mit Agrin (100 ng / ml) und vorsichtig 2 ml zu den Zellen. ändern Sie vorsichtig die Hälfte des Mediums alle 2 d, Ergänzung stets mit Agrin bis zu einer endgültigen Konzentration von 100 ng / ul. Überwachen Sie die Zelldifferenzierung und Lebensfähigkeit. In Abhängigkeit von einer Vielzahl von Faktoren ab (wie FBS und chicken Embryo Extrakt Ursprung), könnte nehmen die Zellen zwischen 5-10 Differenzierung d vollständige Reifung (Abbildung 2) zu erreichen. 4. Immunostaining in Glasboden Geschirr Für die Immunfärbung, zu jeder Zeit-Punkt von Interesse, waschen Sie die einmal Zellen mit DPBS und fixieren Sie diese mit 4% PFA bei RT für 10 min. Waschen Sie sie zweimal mit DPBS. An diesem Punkt können die Zellen bei 4 ° C gelagert werden. Permeabilisieren sie mit 0,5% Triton X-100 für 5 min bei RT. Waschen Sie sie zweimal mit PBS und Block mit 30 min bei RT-blockierende Lösung. Inkubieren sie mit dem primären Antikörper verdünnt in Blockierungslösung O / N bei 4 ° C. Wasch 3x mit DPBS für 5 min bei RT. Inkubieren sie mit dem sekundären Antikörper, und 0,2 & mgr; g / ml DAPI für 1 h bei RT. Wasch 3x mit DPBS für 5 min bei RT. In 200 ul Eindeckmediums und fahren Sie mit Bildgebung.