In Vitro дифференциацию зрелых мышечных волокон для живых изображений

Примечание: Один Урожайность мыши достаточно миобласты в течение приблизительно двух 35 мм чашки или два блюда живой визуализации, так что план циновки, рассечения и покрытия (шаг 2,6) соответственно. Так как миобластов изолированы посредством последовательных центрифугировани и перед металлизацией, протокол должен быть осуществлен в партиях от 5 – 10 животных. Все процедуры, связанные с субъектов животных были одобрены Комитетом по этике животных по крайней Instituto де Medicina молекулярной и Университет Пьера и Марии Кюри 1. Вскрытие неонатальной Мыши Мышцы задних конечностей Подготовьте все решения заранее (Материалы таблицы) и стерилизуют фильтрацией (фильтр 0,22 мкм). Убедитесь , что все средства массовой информации , при 37 ° C перед добавлением к клеткам, за исключением составов , содержащих мембранную матрицу основания (например, Matrigel). Стерилизовать рассечение материал (по одному из: изогнутые ножницы, прямые ножницы, обычные щипцы,и тонкий кончик пинцетом) и верстак, протирая их 70% -ным этанолом. Приготовьте 100 мм чашки Петри с помощью 5 мл Дульбекко фосфатно-солевом буферном (DPBS) для сбора мышц и держать его на льду до стадии мясорубки. Обезглавьте P6 – P8 мышей с прямыми ножницами и стерилизовать кожу с 70% этанола. Сделайте надрез в коже спины и осторожно потяните ее в сторону задних конечностей, пока она не будет удалена, полностью обнажая мускулатуру задних конечностей. Используйте пинцет для удаления жировой ткани без повреждения мышц. Для того, чтобы удалить спинные мышцы задних конечностей, держать конечность растянутую и согнуть лапу, чтобы выставить пятки сухожилия. Используйте изогнутые ножницы, чтобы отделить мышцу от кости, начиная от сухожилий, осторожно скольжения и резки вверх. Акцизный мышцы и поместить их в замороженными ДЗФР. Изолировать четырехглавой мышцы, зажимая мышцы с тонкой кончик пинцетом и резка вокруг него без повреждения бедра или коленного сустава. После рассечения всех животных, переходите к стерильным ламинарного потока капот культуре клеток, где должны быть выполнены все следующие шаги. 2. миобластов Изоляция Удалите избыток ДЗФР. Фарш ткани стерильными ножницами изогнутыми, чтобы получить однородную массу. Сбор измельченной ткани в центрифужную пробирку 50 мл коническую с использованием 5 мл сбраживания смеси и инкубировать ее при перемешивании при 37 ° С в течение 90 мин. Остановить пищеварение путем добавления 6 мл рассечение среды и центрифуге суспензию в течение 5 мин при 75 мкг, чтобы осадить оставшиеся ткани. Осторожно собрать надосадочную жидкость. Убедитесь в том , чтобы не собирать мусор ткани. Центрифуга его при 350 мкг в течение 5 мин; ресуспендируют его в 5 мл среды диссекции. Суспензию фильтруют через клеточную ячейки фильтра 40 мкм. Добавить 25 мл среды диссекции и preplate его в 150 мм чашке в течение 4 ч в инкубаторе для клеточных культур (37 & deg ; С и 5% СО 2 </ Суб>), чтобы позволить фибробласты придерживаться. В то время как перед металлизацией, пальто блюда с 500 мкл матрицы базальной мембраны, разведенным 1: 100 в холодной IMDM в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают один раз ДЗФР и немедленно высевания клетки (шаг 2.8) или оставить со средой роста до посева. После того, как перед металлизацией, собирают супернатант и центрифугируют его при 350 х г в течение 10 мин. Ресуспендируют его в среде роста и подсчета клеток на гемоцитометра. Отрегулируйте громкость так, что между 150 000 и 250000 клетки высевают на базальной мембраны матрицы покрытием блюдо. Сохранить клетки в культуре клеток инкубаторе. 3. Дифференциация мышечное волокно ПРИМЕЧАНИЕ: После 3 дней, клетки должны начать взрывателем и формы мышечных трубочек на уровне около 70% сплошности (рис 1B). В этот момент, трансфекции клеток, если это желательно, с миРНК или представляющую интерес ДНК. Если клетки не быть трансфицированы, Непосредственный переход к дифференциации средних и лыжир к шагу 3.4. Трансфекцию с реагентами трансфекцию следующими инструкциями изготовителя. Инкубируйте клетки в течение 5 ч с миРНК-липидных комплексов (20 нМ + 1 мкл реагента) или ДНК-липидных комплексов (1 мкг + 1 мкл реагента). Оптимизация концентрации миРНК и ДНК, если это необходимо. Вымойте их, как только с дифференциацией среды, а затем перейти к новой дифференциации среды. На следующий день, разбавить мембранную матрицу базальную 1: 2 в ледяном дифференциации среды. Удалите существующую среду и добавьте 200 мкл охлажденного льдом матрицы в каждую чашку. Инкубировать в течение 30 мин в инкубаторе для клеточных культур. Дополнение дифференцировку среды агрином (100 нг / мл) и осторожно добавляют 2 мл к клеткам. Тщательно изменить половину среды каждые 2 D, всегда дополняя агрином до конечной концентрации 100 нг / мкл. Монитор дифференцировки клеток и жизнеспособность. В зависимости от ряда факторов (таких как FBS и CHicken эмбриона экстракт происхождение), клетки может занять от 5 – 10 дифференцирование для достижения полного созревания (рисунок 2). 4. Иммунологическое в стеклянным дном блюда Для иммунное окрашивание, в любой временной точке интереса, промыть клетки один раз с ДЗФР и зафиксировать их с 4% PFA при комнатной температуре в течение 10 мин. Вымойте их дважды ДЗФР. В этот момент клетки можно хранить при температуре 4 ° С. Проницаемыми их с 0,5% Triton X-100 в течение 5 мин при комнатной температуре. Промыть их в два раза ПБС, а затем блокируют блокирующим раствором в течение 30 мин при комнатной температуре. Выдержите их с первичным антителом, разведенным в блокирующем растворе O / N при температуре 4 ° С. Промыть 3 раза с ДЗФР в течение 5 мин при комнатной температуре. Выдержите их с вторичным антителом, и 0,2 мкг / мл DAPI в течение 1 ч при комнатной температуре. Промыть 3 раза с ДЗФР в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавить 200 мкл монтажной среды и приступить к визуализации.