라이브 영상에 대한 성숙한 근섬유의 체외 분화
Summary
Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.
Abstract
골격 근육은 근섬유 가장 큰 포유 동물의 체내에서 세포와 몇 syncytia의 한 구성된다. 어떻게 그것을 구성하는 복잡하고 진화 적으로 보존 된 구조를 조립하는 조사를 받고 남아있다. 크기와 생리 학적 기능은 종종 조작 및 이미징 응용 프로그램을 제한. 불멸화 세포주의 배양에 널리 사용되지만, 단지 분화의 초기 단계를 복제 할 수있다.
여기, 우리는 기본 마우스 근육 아세포에서 발생하는 근섬유의 쉬운 유전자 조작을 가능하게하는 프로토콜을 설명합니다. 차별화 일주일 후, 근섬유가 수축 정렬 근섬유 분절과 화음뿐만 아니라 주변 핵을 표시합니다. 전체 분화 과정은 라이브 영상이나 면역 형광 다음에 할 수 있습니다. 이 시스템은 기존의 생체 외 및 생체 외 프로토콜의 이점을 결합한다. 쉽고 효율적인 형질 전환의 가능성뿐만 아니라,모든 분화 단계에 대한 접근의 용이성 응용 가능성을 넓게. 근섬유이어서 관련 발생 및 세포 생물학 문제를 해결할뿐만 아니라, 임상 적 적용을위한 근육 질환 표현형을 재현 할뿐만 아니라, 사용될 수있다.
Introduction
골격근은 몸무게 1 40 %를 구성한다. 근육 관련 질환은 엄청난 건강과 경제적 부담이를 나타냅니다. 이 매우 복잡하고 조직화 된 조직이 형성 유지 및 재생하는 방법을 광범위하고 잘 확립 된 연구 분야를 구성한다. 6 – 특정 과학적인 관심에 따라 가장 적합한 방법은 생체 내 모델 3 복잡한 간단한 myotube 문화에 이르기까지 다양 할 수 있습니다.
이 프로토콜의 목적은 실시간 영상 및 면역을 통한 근육 생성을 모니터링 할 수있는 시험 관내 시스템을 제공하는 것이다. 전통적인 접근 방법에 비해,이 시스템은 마우스 근육 조직 과정에 매우 완전한 동적 통찰력을 제공한다. 세포 횡단 화음 및 주변 핵 (7)를 표시하는 성숙한, 다핵 근섬유에 근원 세포 단계에서 따라 할 수 있습니다. 이 성숙 수준 수복잡한 자극 또는 기계 장치를 필요로하지 않고, 보통 세포 배양 장치를 이용하여 달성 될 수있다. 체외 시스템에 약간의 성공은 8,9를보고되었지만, 우리의 지식, 이것은 횡 근질 그물 자리 (SR)와 결합 T-tubules와 성숙 마우스 근섬유를 생성하는 유일한 프로토콜입니다. 따라서,이 시험 관내 시스템은 여전히 좋지 10 이해 트라이어드 형성의 분자 메커니즘을 연구하기 위해 이용 될 수있다.
본 시스템의 또 다른 장점은 항체, 약물, 및 RNAi의 도구로서 유효 마우스 타겟 자원의 가용성이다. 비교적 간단한 프로토콜은 힘든 단계, 고도로 숙련 된 조작, 또는 고가의 전용 장비를 필요로하지 않습니다. 성숙 근섬유는 칼슘 스파크 (게시되지 않은 데이터)과 함께 수축력을 표시, 문화의 분화 (7)의 5 D 후 나타나는 시작합니다. 일주에서, 다른 개발포유 동물 신체에서 가장 복잡한 셀들 중 하나의 스테이지 등은 시험 관내 분석의 다양한 조합으로 연구 될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
기본 아세포의 배양이 프로토콜의 사용은 크게 근섬유의 개발을 육성 특별한 틈새가 발생한다. 이것은 매우 적은 수에 존재하는 다른 유형의 세포에 부분적으로 기인한다. 근원 세포 농도와 문화의 순도 사이의 균형을 달성해야합니다. 좋은 세포 배양 물은 배지 조성물에 사용되는 제품의 품질에 의존한다. 동물의 소스에서 파생 된 모든 제품은 철저하게 테스트해야합니다. 우리의 경험에 의하면, 소화 상태도 모니터링해야합니다.
차 문화에 대한 평소와 같이, 실험적인 변화는 고립 된 섬유 또는 불후의 근육 아세포와 연구에 비해 높을 수있다. 이 변화는 매체 및 소화 구성 요소, 마우스의 나이와 크기 및 문화 조작 및 결과 수집에 대한 시점의 표준화에 의해 감소 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 복잡한 메커니즘 실시간 면밀히 장점근섬유 개발에 필요한 크게 변동의 단점을 능가한다.
이 프로토콜은 세포 분화를 손상시키지 않고 생체 외 접근법의 이점을 부여한다. 화음이 형성되고 수축 칼슘 스파크에 결합 될 때까지 근섬유 성숙. 이 기능 출력은 다른 실험 조건에 액세스 할 수 있습니다. 또한, 상기 프로토콜에 대한 다양한 기술 변형이있을 수있다. 근육 아세포는 근육 발달에 관한 관심의 돌연변이와 신생아 생쥐에서 수확 할 수 있습니다. 세포 분화 다른 시점에서의 생화학 적 분석에 용해 될 수있다. 칼슘 지표의 역학을 수행하는 문화에 추가 할 수 있습니다. Optogenetic 구조는 특정 신호 전달 경로를 적용하거나 특정 지역 응답을 유도하는데 사용될 수있다. 마지막으로, 근섬유가 상호 작용을 연구하는 다른 세포 유형과 함께 공동 배양 될 수있다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Fundação para a Ciência e Tecnologia (MP).
Materials
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
| IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
| Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be <1.5 |
| Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
| Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
| Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Fetal Bovine Serum | Eurobio | CVFSVF0001 | |
| Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
| Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200ng/ul |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and Media | |||
| Digestion Mix | in DPBS 5 mg/ml collagenase 3.5 mg/ml dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
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| Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
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| Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
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| Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
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| Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |
Referências
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