In Vitro Différenciation des myofibres matures pour l' imagerie en direct

NOTE: Un des rendements de souris myoblastes suffisantes pour environ deux boîtes de 35 mm ou deux plats live-imagerie, de sorte que paillassons de plan, la dissection, et revêtement (étape 2.6) en conséquence. Depuis myoblastes sont isolées par centrifugations successives et prédépôt, le protocole doit être effectué par lots de 5 – 10 animaux. Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par le Comité d'éthique animale à l'Institut de médecine moléculaire et de l'Université Pierre et Marie Curie 1. Dissection de souris néonatale Muscles des membres postérieurs Préparer toutes les solutions à l' avance (tableau des matériaux) et stériliser par filtration (filtre de 0,22 um). Assurez – vous que tous les médias sont à 37 ° C avant l' addition aux cellules, à l' exception des formulations contenant sous – sol matrice de la membrane (par exemple, Matrigel). Stériliser le matériel de dissection (un chacun: des ciseaux courbes, ciseaux droits, pinces régulières,et une pince à pointe fine) et le banc de travail en les essuyant avec 70% d'éthanol. Préparer un plat de 100 mm de Pétri avec 5 ml de solution saline tamponnée phosphate de Dulbecco (DPBS) pour la collecte des muscles et de la garder sur la glace jusqu'à ce que l'étape de hachage. Décapitez P6 – souris P8 avec des ciseaux droites et stériliser la peau avec 70% d'éthanol. Faire une incision dans la peau du dos et tirez doucement vers les membres postérieurs jusqu'à ce qu'il soit retiré, exposant complètement la musculature des membres postérieurs. Utilisez la pince pour enlever les tissus adipeux sans endommager les muscles. Pour supprimer les muscles dorsaux des membres postérieurs, garder le membre tendu et plier la patte pour exposer les tendons du talon. Utilisez les ciseaux courbes de muscle séparé de l'os, à partir des tendons, en faisant coulisser doucement et coupe vers le haut. Exciser les muscles et les placer dans DPBS glacé. Isoler les quadriceps en pinçant le muscle avec une pince à pointe fine et couper autour d'elle, sans endommager le fémur ou l'articulation du genou. Après dissection tous les animaux, procéder à une hotte à flux laminaire de culture cellulaire stérile, où toutes les étapes suivantes doivent être effectuées. 2. myoblastes Isolation Retirer l'excès de DPBS. Émincer le tissu avec des ciseaux courbes stérilisées afin d'obtenir une masse uniforme. Recueillir le tissu haché dans un tube à centrifuger conique de 50 ml à l'aide de 5 ml de la digestion et de mélange incuber sous agitation à 37 ° C pendant 90 min. Mettre un terme à la digestion en ajoutant 6 ml de milieu de dissection et centrifuger la suspension pendant 5 mn à 75 x g pour sédimenter les tissus restants. Recueillir soigneusement le surnageant. Assurez – vous de ne pas ramasser les débris de tissu. Centrifuger à 350 g pendant 5 min; remettre en suspension dans 5 ml de milieu de dissection. Filtrer la suspension de cellules à travers un tamis cellulaire de 40 pm. Ajouter 25 mL de milieu de dissection et preplate dans un plat de 150 mm pendant 4 h dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C et 5% de CO 2 </ Sub>) pour permettre les fibroblastes adhèrent. Alors que prédépôt, plats manteau avec 500 pi de sous-sol matrice de membrane diluée 1: 100 dans IMDM froid pendant 1 h à température ambiante. Laver une fois avec du DPBS et plaque les cellules immédiatement (étape 2.8) ou à laisser avec un milieu de croissance jusqu'à ce que le placage. Après prédépôt, recueillir le surnageant et centrifuger à 350 g pendant 10 min. Remettre en suspension dans un milieu de croissance et à compter les cellules sur un hémocytomètre. Réglez le volume de sorte qu'entre 150.000 et 250.000 cellules sont étalées par membrane basale plat de matrice revêtu. Maintenir les cellules dans un incubateur de culture cellulaire. 3. myofibre Différenciation NOTE: Après 3 d, les cellules devraient commencer à fusibles et forment myotubes à environ 70% de confluence (figure 1B). A ce stade, transfecter les cellules, si on le désire, avec un ARNsi ou d'ADN présentant un intérêt. Si les cellules ne sont pas à transfecter, passer directement à un milieu de différenciation et de skip à l'étape 3.4. Transfecter avec des réactifs de transfection en suivant les instructions du fabricant. Incuber les cellules pendant 5 h avec des complexes d'ARNsi-lipide (20nm + 1 pl de réactif) ou des complexes d'ADN-lipide (1 pg + 1 pl de réactif). Optimiser les concentrations de siRNA et d'ADN si nécessaire. Lavez-les une fois avec un milieu de différenciation, puis passer à nouveau milieu de différenciation. Le jour suivant, on dilue la matrice de la membrane basale 1: 2 dans un milieu de différenciation glacée. Retirez le support existant et ajouter 200 pi de matrice glacée à chaque plat. Incuber pendant 30 min dans un incubateur de culture cellulaire. Compléter le milieu de différenciation avec l'agrine (100 ng / ml) et on ajoute avec précaution 2 ml aux cellules. changer soigneusement la moitié du milieu tous les 2 d, toujours en complétant avec agrine à une concentration finale de 100 ng / ul. Surveiller la différenciation cellulaire et la viabilité. En fonction de divers facteurs (tels que FBS et cHicken extrait d'embryon origines), les cellules peut prendre entre 5-10 différenciation d pour atteindre sa pleine maturation (figure 2). 4. immunocoloration en plats à fond de verre Pour immunocoloration, à tout moment, point d'intérêt, laver les cellules une fois avec DPBS et les fixer avec 4% de PFA à température ambiante pendant 10 min. Lavez-les deux fois avec DPBS. À ce stade, les cellules peuvent être conservées à 4 ° C. les perméabiliser avec 0,5% de Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante. Lavez-les deux fois avec du PBS et bloquer avec une solution de blocage pendant 30 min à température ambiante. les Incuber avec l'anticorps primaire dilué dans une solution de blocage O / N à 4 ° C. Lavage 3x avec du DPBS pendant 5 min à température ambiante. les laisser incuber avec l'anticorps secondaire, et 0,2 pg / ml de DAPI pendant 1 h à température ambiante. Lavage 3x avec du DPBS pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 200 ul de milieu de montage et procéder à l'imagerie.