In Utero Eletroporação Abordagens para estudar a excitabilidade neuronal subpopulações e Conectividade uma única célula
Summary
Este manuscrito fornece protocolos que usam in utero eletroporação (IUE) para descrever a conectividade estrutural dos neurônios no nível de uma única célula e a excitabilidade dos neurônios marcados com fluorescência. A histologia é utilizado para caracterizar dendrítica e projecções axonais. a gravação de célula inteira em fatias agudas é usado para investigar a excitabilidade.
Abstract
O sistema nervoso é composto de uma enorme variedade de tipos neuronais distintas. Estas subpopulações neuronais são caracterizados por, entre outras características, as suas morfologias dendríticas distintos, os seus padrões específicos de conectividade axonal, e as suas respostas de queima selectivos. Os mecanismos moleculares e celulares responsáveis por estes aspectos da diferenciação durante o desenvolvimento ainda são pouco conhecidos.
Aqui, descrevemos os protocolos combinados para a rotulagem e caracterizar a conectividade estrutural e excitabilidade dos neurônios corticais. Modificação do protocolo in utero eletroporação (IUE) permite a rotulagem de uma escassa população de neurônios. Este, por sua vez, permite a identificação e rastreio dos dendritos e axônios dos neurônios individuais, o caracterização precisa da localização laminar de projeções axonais e análises morfométricas. IUE também pode ser utilizado para investigar mudanças na excitabilidadeDe tipo selvagem (WT) ou neurónios geneticamente modificados, combinando-a com a gravação de células inteiras a partir de fatias de cérebro agudas electroporadas. Estas duas técnicas de contribuir para uma melhor compreensão do acoplamento de conectividade estrutural e funcional e dos mecanismos moleculares que controlam a diversidade neuronal durante o desenvolvimento. Estes processos de desenvolvimento têm implicações importantes sobre fiação axonal, a diversidade funcional de neurónios, e a biologia de distúrbios cognitivos.
Introduction
O desenvolvimento de estruturas dendríticas e axonais é uma faceta importante da regulação circuito no sistema nervoso, incluindo no córtex cerebral. Ela desempenha um papel crítico durante a fiação selectiva das diversas subpopulações neuronais. Um certo número de relatórios recentes têm mostrado que, para além de conectividade, a diversidade molecular dos neurónios é reflectida pela aquisição de modos altamente específicos de disparo. No entanto, os mecanismos que determinam a excitabilidade e a conectividade dos subtipos distintos neuronais durante o desenvolvimento, bem como o seu grau de coordenação, são ainda pouco compreendidos 1, 2.
In vivo deficitária e ganho de função para análises permitem o estudo da relação entre o nível de expressão de genes específicos e a sua influência no desenvolvimento do circuito. Em electroporação útero (IUE) é uma técnica amplamente utilizada para estudara função de um gene de interesse em populações neuronais específicas e para estudar os padrões gerais da sua conectividade. No entanto, para determinar as características morfológicas de axónios e dendritos em camadas corticais em ratinhos vivos, é essencial para rotular neurónios escassamente. Um sistema de recombinação Cre combinado com IUE pode ser usado para marcar uma população esparsa de neurónios a uma densidade suficientemente baixa para resolver as projecções emitidos pelas células individuais das lâminas corticais identificados. Este método etiquetas um número suficiente de neurónios por córtex para obter dados quantitativa após a análise de números razoáveis de cérebros electroporadas (Figura 1). Este manuscrito apresenta um método para tal análise multa de conectividade. Ele também apresenta uma estratégia semelhante para analisar, em experiências separadas, as propriedades elétricas dos neurônios através da realização de gravações de corrente-clamp na proteína verde fluorescente (GFP) -electroporated células de fatias corticais agudas. estes protocóis são versáteis e pode ser aplicada ao estudo da excitabilidade e conectividade dos neurónios de animais transgénicos e WT, e também de neurónios em que os ganhos e perdas de função são introduzidas por plasmídeos adicionais durante IUE.
Embora este protocolo descreve a electroporação de ratinhos no dia embrionário (E) 15,5, esta técnica pode ser realizada em qualquer idade entre 3 e E9.5 dia pós-natal (P) 2 4. Enquanto eletroporação em estágios iniciais como alvo neurônios e precursores do tálamo e camadas profundas do córtex, em fase posterior marcas eletroporação camadas mais superficiais (por exemplo, neurônios E15.5 IUE alvos camada II-III). Em resumo, a combinação de IUE com análise morfológica de células única e electrofisiologia é uma ferramenta útil para elucidar os mecanismos moleculares subjacentes à enorme diversidade estrutural e funcional dos neurónios no sistema nervoso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve em detalhe como rotular os neurônios do córtex somatossensorial de C75BL / 6 ratos, a fim de analisar a sua conectividade e sua excitabilidade. Com relação aos métodos existentes, visualiza aspectos exigentes de conectividade, tais como o número de ramos axonais por neurônio, sua topografia precisa, e sua localização anatômica. Ao alterar a posição dos eléctrodos, é possível atingir outras populações de neurónios, tal como o córtex cingulado (manter o mesmo ângulo entre os el?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a R. Gutiérrez e A. Morales por sua excelente assistência técnica e LA Weiss para edição. CGB é financiado pelo Espanhol Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Fundação BBVA e SAF2014-58598-JIN (MINECO) para M. Navarrete e por uma bolsa da Fundação Areces Ramón e concede SAF2014-52119-R e BFU2014-55738-redt (de MINECO) para M. Nieto.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
Referências
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