In Utero Elektroporatie benaderingen om de prikkelbaarheid van neuronale subpopulaties en Single-cell Connectivity Studie
Summary
Dit manuscript biedt protocollen die gebruik maken van in de baarmoeder elektroporatie (IUE) om de structurele connectiviteit van neuronen te beschrijven op het single-cell niveau en de prikkelbaarheid van fluorescent gelabelde neuronen. Histologie wordt gebruikt dendritische en axonale uitsteeksels karakteriseren. Whole-cell opname in acute plakjes wordt gebruikt om prikkelbaarheid te onderzoeken.
Abstract
Het zenuwstelsel bestaat uit een breed assortiment van verschillende neuronale types. Deze neuronale subpopulaties worden gekenmerkt door, onder andere functies, hun verschillende dendritische morfologie, hun specifieke patronen van axonale connectiviteit, en hun selectieve stoken reacties. De moleculaire en cellulaire mechanismen die aan deze aspecten van differentiatie tijdens de ontwikkeling nog steeds slecht begrepen.
Hier beschrijven we gecombineerde protocollen voor etikettering en karakteriseren van de structurele connectiviteit en prikkelbaarheid van corticale neuronen. Wijziging van de in de baarmoeder elektroporatie (IUE) protocol maakt de etikettering van een geringe bevolkingsdichtheid van neuronen. Dit op zijn beurt maakt de identificatie en het volgen van de dendrieten en axonen van individuele neuronen, de precieze karakterisering van de laminaire locatie van axonale uitsteeksels en morfometrische analyse. IUE kan ook worden gebruikt om veranderingen in de prikkelbaarheid van onderzoekenwild-type (WT) of genetisch gemodificeerde neuronen door het te combineren met whole-cell opname van acute plakjes geëlektroporeerd hersenen. Deze twee technieken bijdragen tot een beter begrip van de koppeling van structurele en functionele connectiviteit en de moleculaire mechanismen die neuronale diversiteit tijdens de ontwikkeling. Deze ontwikkelingsprocessen hebben belangrijke gevolgen voor de axonen bedrading, de functionele diversiteit van neuronen, en de biologie van cognitieve stoornissen.
Introduction
De ontwikkeling van de dendritische en axonale structuren is een belangrijk facet van het circuit regelgeving in het zenuwstelsel, met inbegrip van in de cerebrale cortex. Het speelt een belangrijke rol tijdens de selectieve bedrading van de verschillende neuronale subpopulaties. Een aantal recente rapporten aangetoond dat, naast verbinding, wordt de moleculaire diversiteit van neuronen gereflecteerd door het verkrijgen van zeer specifieke wijze van bakken. De mechanismen die de exciteerbaarheid en connectiviteit van de afzonderlijke neuronale subtypes tijdens de ontwikkeling, en de mate van coördinatie, zijn nog slecht begrepen 1, 2.
In vivo verlies- en gain-of-function analyses oog op het onderzoek naar de relatie tussen de expressie van specifieke genen en hun invloed op de ontwikkeling van de schakeling. In utero elektroporatie (IUE) is een techniek veel gebruikt studerende functie van een gen van belang in specifieke neuronale populaties en de algemene patronen van de verbindingen te bestuderen. Echter, de morfologische kenmerken van axonen en dendrieten in corticale lagen in levende muizen te bepalen, is het essentieel om neuronen dun label. Een Cre recombinatie systeem gecombineerd met IUE kan worden gebruikt om een schaarse populatie van neuronen te markeren op een voldoende lage dichtheid dat uitstekende uitgezonden door individuele cellen van de geïdentificeerde corticale laminas lossen. Deze methode etiketten voldoende aantal neuronen per cortex kwantitatieve gegevens te verkrijgen na de analyse van redelijke hoeveelheden geëlektroporeerd hersenen (figuur 1). Het manuscript geeft een werkwijze voor zulke fijne analyse van connectiviteit. Het bevat ook een soortgelijke strategie te analyseren, in afzonderlijke experimenten, de elektrische eigenschappen van neuronen door het uitvoeren stroom-clamp op groene fluorescentie eiwit (GFP) -geëlektroporeerde cellen acute corticale schijfjes. deze proprotocollen zijn veelzijdig en kan worden toegepast op de studie van de prikkelbaarheid van neuronen en connectiviteit van WT en transgene dieren, alsmede van neuronen waarbij verliezen en winsten functie van aanvullende plasmiden worden geïntroduceerd tijdens IUE.
Hoewel dit protocol beschrijft de elektroporatie van muizen op embryonale dag (E) 15,5 Deze techniek kan worden uitgevoerd op elke leeftijd tussen E9.5 en postnatale dag 3 (P) 2 4. Terwijl elektroporatie in een vroeg stadium is gericht op neuronen en voorlopers van de thalamus en de diepe lagen van de cortex, later stadium elektroporatie merken meer oppervlakkige lagen (bv E15.5 IUE targets laag II-III neuronen). Samengevat, de combinatie van IUE met eencellige morfologische analyse en elektrofysiologie is een nuttig hulpmiddel om de moleculaire mechanismen waardoor enorme structurele en functionele diversiteit van neuronen in het zenuwstelsel helderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft in detail hoe neuronen van de somatosensorische cortex van C75BL / 6 muizen label om hun connectiviteit en hun prikkelbaarheid analyseren. Bij de bestaande methoden, visualiseren uw onderscheidende aspecten van connectiviteit, zoals het aantal van axonale vertakkingen per neuron, de precieze topografie en de anatomische locatie. Door het veranderen van de positie van de elektroden, is het mogelijk te richten andere neuronenpopulaties, zoals de cingulate cortex (behoud van dezelfde hoek tussen de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn dankbaar voor R. Gutiérrez en A. Morales voor hun uitstekende technische bijstand en naar LA Weiss om te bewerken. CGB wordt gefinancierd door het Spaanse Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Dit werk werd gefinancierd door een subsidie van BBVA Foundation en SAF2014-58598-JIN (MINECO) naar M. Navarrete en door een subsidie van de Ramón Areces Foundation en subsidies SAF2014-52119-R en BFU2014-55738-Redt (van MINECO) naar M. Nieto.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
Referências
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
