Vild type Blokering af PCR Kombineret med direkte sekventering som en yderst følsom metode til påvisning af lavfrekvent somatiske mutationer

Sanger-sekventering har traditionelt været guldstandarden inden for testning for både kendte og ukendte somatiske mutationer. En af begrænsningerne ved Sanger-sekventering er dens detektionsgrænse (~ 10 – 20% mutant allel i en baggrund af WT) ^1. Dette niveau af følsomhed er uhensigtsmæssig til påvisning lavt niveau somatiske mutationer, som kan være til stede i prøver fra præmaligne væv eller patienter med få cirkulerende tumorceller, eller når knoglemarv (BM) er fragmentarisk. Dette gør det også vurdere residual sygdom efter terapi eller påvisning nye resistens-mutationer under behandling vanskeligt ved konventionel sekventering alene ^2. Ved at erstatte konventionel PCR med låst nukleinsyre (LNA) -medieret vildtype blokerende PCR (WTB-PCR) i Sanger-sekventering, kan opnås følsomheden af op til 0,1% mutantallel i en baggrund af WT ^{2, 3, 4.} IWTB-PCR, berigelse for mutantalleler opnås via tilsætning af en kort (~ 10-14 NT) blokering (LNA) oligonukleotid, der binder fortrinsvis til WT DNA derved forhindre amplifikation af WT DNA. Mutanten beriget WTB-PCR-produkt kan derefter sekventeret. Ved at blokere WT DNA stedet for at vælge for specifikke mutationer WTB-PCR tillader berigelse af både kendte og ukendte mutationer i ganske små cellefraktioner.

Flere metoder anvendes for tiden til påvisning af mutationer i små celler fraktioner. Dette omfatter allel-specifik PCR amplifikation-mutationssystemanalyse (ARMS), denaturerende højtryksvæskekromatografi (DHPLC), perler, emulsioner, amplifikation, og magnetics (strålede), elektrisk felt-inducerede frigivelse og måling (EFIRM), høj opløsning smeltepunkt og andre. De fleste af disse fremgangsmåder er begrænset af falske positive og evnen til kun at detektere en mutation at assayet var designet til ⁴ </sup>. WTB-PCR, men giver brugeren mulighed for at visualisere sekventering spor, der gør det muligt for påvisning af flere mutation typer og kan støtte i at udelukke falsk positive på grund af artefakter eller deaminerings- begivenheder. Næste generation sekventering (NGS), kan tilbyde et egnet alternativ til konventionel sekventering imidlertid væsentligt større omkostninger, kompleksitet og længere assaytid gøre det en unødvendig mulighed for mange sygdomstilstande typer med få distinkte molekylære markører eller til overvågning af patienter på terapi for nye resistensmutationer. Endvidere høje falske positive satser, når påvisning varianter med mutante allel frekvenser på mindre end 5% kan udgøre et problem for amplicon-baserede NGS ^{5, 6.}

Her demonstrerer vi stigningen i følsomhed opnås ved WTB-PCR i screening for mutationer i den myeloide differentieringsfaktor 88-genet som beskrevet af Albitar et al. ³ MyD88 mutations er vigtige diagnostiske og prognostiske faktorer i Waldenströms makroglobulinæmi (WM), IgM monoklonal gammopati af ukendt betydning (IgM-MGUS), miltmarginalzonen lymfom (SMZL), og diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL). MyD88 mutationer findes i næsten alle tilfælde af WM og ca. 50% af patienter med Immunoglobulin M (IgM) -secreting MGUS. Contrastingly, er MyD88 mutationer findes i kun 0-6% af patienterne med SMZL og er fraværende i myelomatose ^{7, 8.} Fordi overlappende morfologisk, immunfænotypisk, cytogenetiske og kliniske karakteristika mellem WM og SMZL eller IgM-myelomatose kan ofte komplicere differentierede diagnoser, kan tilstedeværelsen af en MyD88 mutation tjene som en nyttig identificere faktor ^9. MyD88 mutationer er også blevet forbundet med større sygdomsbyrde hos patienter med DLBCL og dårlig samlet overlevelse efter terapi ^7, </sup> ^10. Desuden, fordi MyD88 mutationer hyppigere findes i aktiverede B-celle-lignende (ABC) DLBCL end kimcenter B-celle-lignende (GCB) DLBCL eller primær mediastinal B-celle lymfom (PMBL), kan MyD88 mutation status tjene som en surrogatmarkør for ABC undertype ^{11, 12.}

Den detaljerede protokol billede her tjener som en skabelon, som kan udvikles nye assays eller de fleste eksisterende sekventeringsreaktioner assays kan let tilpasses nøjagtigt at detektere lavfrekvente mutationer i forskellige prøvetyper. Den fremgangsmåde kan også anvendes til overvågning og detektion af resistente mutationer, som kan udvikle sig i tumorer eller endda bakterier, der kan udvikle mens patienterne behandles med målrettet terapi eller antibiotika. Endvidere omhandler den og retsmidler mange af de spørgsmål, der er forbundet med mutation berigelse, især i formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) væv.