Summary

En enkel ett-trinns Dissection Protokoll for Whole-mount Utarbeidelse av Adult<em> Drosophila</em> Brains

Published: December 01, 2016
doi:

Summary

Den voksne Drosophila hjernen er et verdifullt system for å studere nevrale kretser, høyere hjernefunksjoner, og sammensatte lidelser. En effektiv metode for å dissekere hele hjernevev fra den lille flua hodet vil lette hjernebaserte studier. Her beskriver vi en enkel, ett-trinns disseksjon protokoll av voksne hjerner med godt bevarte morfologi.

Abstract

Det er en økende interesse for å bruke Drosophila å modellere menneskelige hjerne degenerative sykdommer, kart nevrale kretser i voksne hjerner, og studere molekylære og cellulære grunnlag av høyere hjernefunksjoner. En hel-mount forberedelse av voksne hjerner med godt bevarte morfologi er kritisk for slike hele hjernebaserte studier, men kan være teknisk utfordrende og tidkrevende. Denne protokollen beskriver en lett-å-lære, ett-trinns metode disseksjon av en voksen flue hode på mindre enn 10 s, samtidig som den intakte hjerne festet til resten av legemet for å lette etterfølgende behandlingstrinn. Fremgangsmåten bidrar til å fjerne mesteparten av øyet og tracheal vev som normalt er forbundet med hjernen som kan forstyrre den senere billeddannelsestrinn, og også setter mindre krav til kvaliteten på dissekere tang. I tillegg, beskriver vi en enkel fremgangsmåte som tillater praktisk flipping av de monterte hjerneprøver på et dekkglass, som er viktig for å avbilde begge sider av bregner med samme signalintensitet og kvalitet. Som et eksempel på protokoll presenterer vi en analyse av dopaminergiske (DA) neuroner i voksne hjerner av WT (w 1118) fluer. Den høye effekten av disseksjon metoden gjør det spesielt nyttig for store voksen hjerne-baserte studier i Drosophila.

Introduction

Modellen organismen Drosophila, vanligvis kjent som bananflue, har lenge vært verdsatt for sine elegante genetiske verktøy, korte reproduktive ganger, og svært konservert molekylære og cellulære veier. Bananflue har blitt ansatt for å dissekere grunnleggende signalveier, Mønstringen mekanismer for flercellede organismer, samt mekanismene bak nevronale utvikling, funksjoner og sykdommer 1,2. Med nylige fremskritt i celle merking og bildeteknologi, har bananflue hjernen bli spesielt kraftig i fin kartlegging av neuronal kretser og i dissekere den molekylære og cellulære grunnlag av høyere hjernefunksjoner, slik som læring og hukommelse, og døgnrytme 1,3, 4,5,6,7,8.

En spesiell fordel med Drosophila-system er for sin relativt liten størrelse, slik at hel-mount fremstilling og undersøkelse av hjernen ved hjelp av en vanlig forbindelse eller et konfokalt mikroskop. This-funksjonen gjør det mulig detaljerte anatomiske og funksjonelle analyser av nervekretser, eller til en enkelt nervecelle, på cellulære og subcellulære nivåer, i sammenheng med en hel hjernevev, og dermed gi både et helhetlig syn på studert faget og dets eksakte geometri i hele hjerne. Imidlertid gitt heller miniatyrstørrelse av hjernen, representerer den også en teknisk utfordring på en effektiv måte å dissekere et intakt hjernevev ut av den beskyttende ytre skjelett hodet tilfelle i en voksen fly. Forskjellige effektive og relativt enkle disseksjon fremgangsmåter er blitt beskrevet i detalj, som vanligvis innebære forsiktig og trinnvis fjerning av hodet saken og tilhørende vev innbefattende øynene, luftrøret, og fett fra hjernen riktig 9, 10. Disse mikro disseksjon metodene ofte plasserer heller strenge krav til kvaliteten på disseksjon tang, avhengig av tang med fin godt justert tips som lett kan skades. Videre, ettersom de dissekerte hjerner er ofte separated fra resten av kroppen, kan hjernen lett gå tapt i løpet av de påfølgende farging og vaskeprosesser på grunn av sine små størrelser og deres transparens i behandlingen buffer. Her beskriver vi en relativt enkel og lett å lære, ett-trinns disseksjon protokoll for voksne hjerner som holder de dissekerte hjerner festet til overkroppen. Disseksjon prosessen ofte lett rydder unna det meste av hjerne-forbundet vev som øyet og luftrøret og reduserer behovet for god kvalitet disseksjon tang.

I tillegg, når avbilding av hjernen under fluorescerende forbindelse mikroskop eller konfokalt mikroskop, den side av hjernen som er borte fra det fluorescerende lyskilde frembringer ofte et svakere signal og mindre klare bilder på grunn av tykkelsen av det hel-mount hjernen. Her beskriver vi også en enkel montering metode som gjør det mulig enkelt å bla i hjerneprøvene, slik at praktisk avbildning av begge sider av hjernen med tilsvarende signal intensiTy og kvalitet.

Som et proof-of-concept for anvendelsen av denne metoden for å studere den voksne hjernen, vi videre undersøkt tilstedeværelsen av DA nevroner i hjernen til w 1118 fluer; en genotype som ofte brukes som foreldrelinjen for å generere transgene fluer og villtype kontroll i mange Drosophila studier.

Protocol

1. Solutions Brukes for Brain Dissection og Immunofluorescent Farging Dissekere voksen hjerne fly i kunstig cerebral spinalvæske (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 1,3 mM MgCl2, og 10 mM glukose. Før bruk gass den aCSF med 5% CO2 / 95% O 2 i 10 – 15 min og pigg med 2,5 mM CaCl2. Steriliser aCSF oppløsningen ved filtrering gjennom et 0,22 um membranfilter. Merk: Oppbevar aCSF ve…

Representative Results

Figur 1 illustrerer de viktigste prosedyrer for voksen hjerne disseksjon, som beskrevet ovenfor, figur 2 og 3 er representative bilder av 3 dager gammel WT. (Genotype: w 1118) voksen fly hjerner, som ble costained med et antistoff mot tyrosinhydroksylase (TH , farget i rødt på figur 2 og hvite i figur 3), en markør som vanligvis brukes til å merke dA-nevroner 11, i till…

Discussion

Med en økende interesse for å bruke voksen Drosophila hjernen for å studere menneskelige hjerne sykdommer, nevronale kretser, og høyere hjernefunksjoner, er det nødvendig å utvikle enkle og raske metoder for å få intakte flue hjerner for hel-mount analyser, noe som er spesielt viktig for stor- skalere hjerne-baserte skjermer. Vår metode gir en enkel og lett-å-lære tilnærming til å dissekere ut en flue hode (ofte i mindre enn 10 sek med erfaring) med godt bevarte morfologi som er i stor grad ryddet …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi erkjenner Mr. Enes Mehmet, Ms Kiara Andrade, Ms Pilar Rodriguez, Chris Kwok, og Ms Danna Ghafir for deres enorme støtte til prosjektet.

Materials

w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 Bloomington Drosophila Stock Center 51652 Balancer was switched to TM6B
PBac{WH}parkf01950 Exelixis at Harvard Medical School f01950 Balancer was switched to TM6C
NaCl Fisher Scientific S640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3 Fisher Scientific 02-003-990
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) Fisher Scientific 02-004-198
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific 02-003-265
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G Replaces glucose
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size Fisher Scientific GVWP14250
Formalin Solution, 10% (Histological) Fisher Scientific SF98-20
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent Fisher Scientific 02-003-823
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points Fisher Scientific 17-456-055 Protocol does not require very fine points. 
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Pel-Freez Biologicals P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav The Developmental Studies Hybridoma Bank Clone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate ThermoFisher Scientific A-21247
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific A-11037
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Propyl gallate powder Sigma-Aldrich P3130-100G
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% Sigma-Aldrich G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1 Zeiss Quote
Zeiss Apotome.2 Zeiss Quote
Zen lite software Quote

Referências

  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genética. 199, 639-653 (2015).
  2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
  3. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
  4. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
  5. Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
  6. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
  7. Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
  8. Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  11. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
  12. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
  13. Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
  14. Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
  15. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
  16. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
  17. Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson’s disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
  18. Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
check_url/pt/55128?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (118), e55128, doi:10.3791/55128 (2016).

View Video