Summary

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em> Drosophila</em> Brain

Published: December 01, 2016
doi:

Summary

Yetişkin Drosophila beyin nöronal devreleri, yüksek beyin fonksiyonları ve karmaşık bozuklukları çalışmak için değerli bir sistemdir. Etkin bir yöntem, beyin temelli çalışmalar kolaylaştıracak küçük sinek kafasından tüm beyin dokusu incelemek için. Burada iyi korunmuş morfolojisi ile yetişkin beyinlerinde basit, tek adımlı diseksiyon protokol açıklar.

Abstract

İnsan beyni dejeneratif hastalıkların modeli yetişkin beyinlerinde nöronal devreler harita ve yüksek beyin fonksiyonlarının moleküler ve hücresel temelini incelemek için Drosophila kullanarak artan bir ilgi vardır. iyi korunmuş morfolojisi erişkin beyinlerinin bir bütün montaj hazırlığı gibi tüm beyin temelli çalışmalar için kritik, ama teknik olarak oldukça zor ve zaman alıcı olabilir. takip eden işlem aşamalarını kolaylaştırmak için vücudun geri kalan bağlı bozulmamış beyin tutarken Bu protokol, en az 10 s bir yetişkin sinek kafasının kolay öğrenmek için, tek-aşamalı bir diseksiyon yaklaşımı tarif eder. prosedür normalde daha sonra görüntüleme adımla engelleyebilir beyin ile ilişkili göz ve trakea dokuların en temizlenmesine yardımcı olur ve aynı zamanda diseksiyon forseps kalitesine daha az talep yerleştirir. Buna ek olarak, B her iki tarafına görüntüleme için önemli olan bir lamel üzerine monte edilmiş, beyin örnekleri uygun bir çevirme sağlayan basit bir yöntem tarifbenzer sinyal yoğunluğu ve kalitesi ile yağmurlar. Protokolün bir örneği olarak, biz WT yetişkin beyinlerinde dopaminerjik (DA) nöronların ilişkin bir analizi sunması (1118 w) uçar. Diseksiyon yöntemi yüksek etkinlik Drosophila büyük ölçekli yetişkin beyin temelli çalışmalar için özellikle yararlı hale getirir.

Introduction

Yaygın meyve sineği olarak bilinen model organizma Drosophila, uzun zarif genetik araçlar, kısa üreme kez değerlemeye tabi tutulmuştur ve son derece moleküler ve hücresel yollar korunmuş bulunmaktadır. Meyve sineği başarıyla temel sinyal yollarını, çok hücreli organizmaların desenlendirme mekanizmaları yanı sıra nöronal gelişimi, işlevleri altında yatan mekanizmaları ve hastalıkları 1,2 teşrih istihdam edilmiştir. Hücre etiketleme ve görüntüleme teknolojilerindeki son gelişmelerle birlikte, meyve sineği beyin, nöronal devrenin ince haritalama ve öğrenme ve hafıza ve sirkadiyen ritim 1,3 gibi yüksek beyin fonksiyonları, moleküler ve hücresel temelini diseksiyon özellikle güçlü hale geldi 4,5,6,7,8.

Drosophila sisteminin bir avantajı normal bir bileşik veya konfokal mikroskop kullanılarak beyin tüm montaj hazırlanması ve incelenmesini sağlayan nispeten küçük bir boyutudur. This özelliği dolayısıyla bütünün içinde bir çalışılan konu bütüncül bakış ve onun tam geometri hem sağlayarak, tüm beyin dokusunda bağlamında, hücresel ve hücre içi düzeyde nöronal devrenin detaylı anatomik ve fonksiyonel analiz, hatta tek bir nöronu mümkün kılar beyin. Ancak, beynin oldukça minyatür boyutu göz önüne alındığında, aynı zamanda verimli bir yetişkin sinek koruyucu dış iskelet kafa davanın dışında sağlam bir beyin dokusunu diseksiyon teknik bir meydan okuma sunuyor. Çeşitli etkili ve nispeten basit diseksiyon yöntemleri genellikle dikkatli içerir ve adım adım kafa durumda kaldırılmasını ve gözler dahil ilişkili dokuları, trakea ve yağ 9, 10. Bunlar mikrocerrahi diseksiyon yöntemlerinin doğru beyin, hangi detaylı bir şekilde tarif edilmiştir genellikle kolayca zarar görebilir ince iyi hizalanmış ipuçları forseps dayanarak, diseksiyon forseps kalitesi oldukça sıkı talepleri yerleştirin. Dahası, disseke beyinler genellikle separat vardırvücudun geri kalan ed, beyinleri nedeniyle kolayca, küçük boyutları ve işlem tampon maddesi içinde şeffaflığının daha sonra boyanması ve yıkama işlemleri sırasında kaybolabilir. Burada, gövde bağlı disseke beyinleri tutan yetişkin beyinlerinde için, nispeten basit ve kolay öğrenilebilen bir adım diseksiyon protokol açıklar. Diseksiyon işlemi genellikle kolay gibi göz ve trakea gibi beyin ilişkili dokuların en uzak temizler ve kaliteli diseksiyonu forseps ihtiyacını azaltır.

floresan bileşik mikroskop veya konfokal mikroskop altında beyin görüntüleme, ayrıca, uzak floresan ışık kaynağından beynin yan nedeniyle genellikle tüm montaj beyin kalınlığı zayıf bir sinyal ve daha az net görüntüler üretir. Burada, biz de benzer sinyal intensi ile beynin her iki tarafın uygun görüntüleme sağlayan, beyin numunelerinin kolay saygısız sağlayan basit bir montaj yöntemi açıklarty ve kalite.

Bir kanıtı-of-concept yetişkin beyin incelemek için bu yöntemin uygulanması için, biz daha 1118 sinekler w beyinlerinde DA nöronların varlığını incelendiğinde; genellikle transgenik sinekler ve birçok Drosophila çalışmalarında vahşi tipli denetimi oluşturmak için ebeveyn hattı olarak kullanılan bir genotip.

Protocol

Beyin Diseksiyon ve Immunofluorescent Boyama için kullanılır 1. Çözümler Yetişkin yapay serebral spinal sıvı içinde beyinleri sinek teşrih (CSF): 119 mM NaCl, 26.2 mM NaHCO 3, 2.5 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO 4, 1.3 mM MgCl2, 10 mM glükoz. Kullanmadan önce, gaz% 5 CO 2/95 10% O 2 ile aCSF – 2.5 mM CaCl2 ile 15 dakika ve başak. 0.22 um'lik bir membran filtresinden süzülerek ACSF çözüm sterilize edin. Not…

Representative Results

Yukarıda tarif edildiği gibi Şekil 1, yetişkin beyin diseksiyonu için ana prosedürleri gösterir 2 Şekiller ve 3 3 günlük bir WT temsilcisi görüntüler. (Genotip: 1118 w) yetişkin tirozin hidroksilaz karşı bir antikor ile costained edildi beyinleri, sinek (TH Şekil 2'de, kırmızı renkli ve Şekil 3) beyaz bir belirteç, genellikle tüm farklılaşmış nöronları…

Discussion

İnsan beyni hastalıkları, nöronal devreleri, ve yüksek beyin fonksiyonlarını incelemek için yetişkin Drosophila beyin kullanarak artan bir ilgi ile, orta serili için özellikle önemlidir tam montaj analizleri, bozulmadan sinek beyinleri elde etmek basit ve hızlı yöntemler geliştirilmesi gerekmektedir beyin temelli ekranlar ölçek. Bizim yöntem basit ve kolay öğrenirler bir sinek kafası dışarı incelemek için bir yaklaşım (genellikle tecrübesi ile en az 10 s) iyi korunmuş morfolojisi i…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz projeye büyük destek Sayın Enes Mehmet, Bayan Kiara Andrade, Bayan Pilar Rodriguez, Chris Kwok ve Bayan Danna Mü'min kabul.

Materials

w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 Bloomington Drosophila Stock Center 51652 Balancer was switched to TM6B
PBac{WH}parkf01950 Exelixis at Harvard Medical School f01950 Balancer was switched to TM6C
NaCl Fisher Scientific S640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3 Fisher Scientific 02-003-990
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) Fisher Scientific 02-004-198
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific 02-003-265
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G Replaces glucose
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size Fisher Scientific GVWP14250
Formalin Solution, 10% (Histological) Fisher Scientific SF98-20
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent Fisher Scientific 02-003-823
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points Fisher Scientific 17-456-055 Protocol does not require very fine points. 
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Pel-Freez Biologicals P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav The Developmental Studies Hybridoma Bank Clone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate ThermoFisher Scientific A-21247
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific A-11037
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Propyl gallate powder Sigma-Aldrich P3130-100G
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% Sigma-Aldrich G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1 Zeiss Quote
Zeiss Apotome.2 Zeiss Quote
Zen lite software Quote

Referências

  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genética. 199, 639-653 (2015).
  2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
  3. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
  4. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
  5. Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
  6. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
  7. Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
  8. Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  11. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
  12. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
  13. Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
  14. Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
  15. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
  16. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
  17. Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson’s disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
  18. Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
check_url/pt/55128?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (118), e55128, doi:10.3791/55128 (2016).

View Video