En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em> Drosophila</em> Brains
Summary
Den vuxna Drosophila hjärnan är ett värdefullt system för att studera neuronal kretsar, högre hjärnfunktioner, och komplexa sjukdomar. En effektiv metod för att dissekera hela hjärnvävnad från den lilla flugan huvudet underlättar hjärnbaserade studier. Här beskriver vi en enkel, ett steg dissektion protokollet för vuxna hjärnor med välbevarad morfologi.
Abstract
Det finns ett ökande intresse av att använda Drosophila att modellera mänskliga hjärnan degenerativa sjukdomar, karta neuronala krets hos vuxna hjärnor, och studera den molekylära och cellulära basen av högre hjärnfunktioner. En hel-mount beredning av vuxna hjärnor med välbevarad morfologi är avgörande för sådana hela hjärnan baserade studier, men kan vara tekniskt utmanande och tidskrävande. Detta protokoll beskriver en enkel att lära sig, en-stegs dissektion tillvägagångssätt av en vuxen fluga huvud på mindre än 10 s, samtidigt som den intakta hjärnan fäst till resten av kroppen för att underlätta efterföljande behandlingssteg. Förfarandet bidrar till att avlägsna det mesta av ögat och luftrör vävnader som normalt förknippas med hjärnan som kan störa senare imaging steg, och även ställer mindre krav på kvaliteten på de dissekera pincett. Dessutom beskriver vi en enkel metod som möjliggör bekväm flipping av de monterade hjärnprover på ett täckglas, vilket är viktigt för bildframställning på båda sidor av bregn med liknande signalintensitet och kvalitet. Som ett exempel på protokollet, presenterar vi en analys av dopaminerga (DA) neuron hos vuxna hjärnan hos WT (w 1118) flugor. Den höga effektiviteten hos den dissekeringsmetod gör det särskilt användbart för storskaliga vuxen hjärna-baserade studier i Drosophila.
Introduction
Den modellorganism Drosophila, allmänt känd som bananflugan, har länge varit uppskattad för sina eleganta genetiska verktyg, korta reproduktiva gånger, och mycket konserverade molekylära och cellulära vägar. Bananfluga har framgångsrikt används för att dissekera grundläggande signalvägar, mönstringen mekanismer för flercelliga organismer, samt de mekanismer som ligger bakom neuronal utveckling, funktioner och sjukdomar 1,2. Med de senaste framstegen inom cell märkning och avbildningstekniker har bananfluga hjärnan blir särskilt stark i fin kartläggning av neuronal kretsar och dissekera den molekylära och cellulära basen av högre hjärnfunktioner, såsom inlärning och minne, och dygnsrytm 1,3, 4,5,6,7,8.
En speciell fördel med Drosophila-systemet är dess relativt ringa storlek, vilket gör att hela montering beredning och undersökning av hjärnan med hjälp av en vanlig förening eller konfokalmikroskop. This funktion möjliggör detaljerade anatomiska och funktionella analyser av neuronala kretsar, eller ens en enda neuron, vid cellulära och subcellulära nivåer, inom ramen för en hel hjärnvävnad, vilket ger både en helhetssyn på den studerade ämnet och dess exakta geometri inom hela hjärna. Men med tanke på den ganska miniatyr storlek i hjärnan, presenterar det också en teknisk utmaning i effektivt dissekera en intakt hjärnvävnad ur skydds exoskelett huvudet fallet i en vuxen fluga. Olika effektiva och relativt enkla dissektion metoder har beskrivits i detalj, vilket vanligtvis innebär noggrann och stegvis avlägsnande av huvudet fallet och omkringliggande vävnader, inklusive ögonen, luftstrupe och fett från hjärnan korrekt 9, 10. Dessa mikro dissektion metoder ofta ställer ganska höga krav på kvaliteten på dissektion pincett, att förlita sig på pincett med fina väl inriktade tips som lätt kan skadas. Eftersom de dissekerade hjärnor är ofta Separated från resten av kroppen, kan hjärnan lätt förloras under efterföljande färgnings och tvättprocesser på grund av deras små storlekar och insyn i processande buffert. Här beskriver vi en relativt enkel och lätt att lära sig, ett steg dissektion protokoll för vuxna hjärnor som håller dissekerade hjärnor kopplade till bålen. Dissektion process som ofta lätt rensar bort det mesta av hjärnrelaterade vävnader såsom ögat och luftstrupe och minskar efterfrågan på god kvalitet dissektion pincett.
Dessutom, när avbildning av hjärnan under fluorescerande förening mikroskop eller konfokalmikroskop, den sida av hjärnan som är borta från den fluorescerande ljuskällan ger ofta en svagare signal och mindre tydliga bilder på grund av tjockleken av hela-mount hjärnan. Här beskriver vi också en enkel montering metod som tillåter enkel vändning av hjärnprover, vilket möjliggör bekväm avbildning av båda sidor av hjärnan med liknande signal intensiTy och kvalitet.
Som ett proof-of-concept för tillämpning av denna metod för att studera den vuxna hjärnan, undersökte vi ytterligare närvaron av DA-neuroner i hjärnan hos w 1118 flugor; en genotyp som ofta används som moderlinjen för att generera transgena flugor och vildtyp-kontroll i många Drosophila studier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med ett ökande intresse för att använda vuxna Drosophila hjärnan att studera mänskliga hjärnsjukdomar, neuronal kretsar och högre hjärnfunktioner, är det nödvändigt att utveckla enkla och snabba metoder för att få intakta fly hjärnor för hel-mount analyser, vilket är särskilt viktigt för stor- skala hjärnbaserade skärmar. Vår metod ger en enkel och lätt att lära sig strategi för att dissekera en fluga huvud (ofta på mindre än 10 s med erfarenhet) med välbevarad morfologi som till stor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner Mr Enes Mehmet, Ms Kiara Andrade, Ms Pilar Rodriguez, Chris Kwok, och Ms. Danna ghafir för deras enorma stöd till projektet.
Materials
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
Referências
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genética. 199, 639-653 (2015).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson’s disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
