एक साधारण एक कदम प्रौढ़ की साबुत माउंट तैयारी के लिए विच्छेदन प्रोटोकॉल<em> ड्रोसोफिला</em> दिमाग
Summary
वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क न्यूरोनल सर्किट, उच्च मस्तिष्क काम करता है, और जटिल विकारों के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है। एक कारगर तरीका छोटी मक्खी सिर से पूरे मस्तिष्क के ऊतकों काटना करने के लिए मस्तिष्क आधारित अध्ययन की सुविधा होगी। यहाँ हम एक सरल, एक कदम विच्छेदन वयस्क दिमाग की अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान के साथ प्रोटोकॉल का वर्णन।
Abstract
वहाँ ड्रोसोफिला का उपयोग, मानव मस्तिष्क अपक्षयी रोगों मॉडल वयस्क दिमाग में neuronal circuitries नक्शा, और उच्च मस्तिष्क कार्यों की आणविक और सेलुलर आधार का अध्ययन करने में एक बढ़ती रुचि है। अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान के साथ वयस्क दिमाग के एक पूरे माउंट तैयारी इस तरह पूरे मस्तिष्क आधारित अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाली हो सकती है। इस प्रोटोकॉल, कम से कम 10 एस में एक वयस्क मक्खी सिर के एक, आसान करने के लिए सीखना एक कदम विच्छेदन दृष्टिकोण का वर्णन करते हुए बाद के प्रसंस्करण की सुविधा के लिए कदम बरकरार शरीर के बाकी हिस्सों से जुड़ी मस्तिष्क रखे हुए हैं। प्रक्रिया सामान्य रूप से मस्तिष्क है कि बाद में इमेजिंग कदम के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के साथ जुड़े आंख और सांस की नली के ऊतकों के सबसे हटाने में मदद करता है, और भी विदारक संदंश की गुणवत्ता पर कम मांग रखता है। इसके अतिरिक्त, हम एक सरल विधि है, जो बी के दोनों ओर इमेजिंग के लिए महत्वपूर्ण है कि एक coverslip पर मुहिम शुरू की मस्तिष्क के नमूनों की सुविधाजनक flipping के लिए अनुमति देता है का वर्णनइसी तरह के संकेत तीव्रता और गुणवत्ता के साथ बारिश। प्रोटोकॉल का एक उदाहरण के रूप में, हम गुम्मट के वयस्क दिमाग में डोपामिनर्जिक (डीए) न्यूरॉन्स के एक विश्लेषण पेश (डब्ल्यू 1118) मक्खियों। विच्छेदन विधि के उच्च प्रभावकारिता यह विशेष रूप से ड्रोसोफिला में बड़े पैमाने पर वयस्क मस्तिष्क आधारित अध्ययन के लिए उपयोगी बनाता है।
Introduction
मॉडल जीव ड्रोसोफिला, आमतौर पर फल मक्खी के रूप में जाना जाता है, लंबे समय से अपनी सुरुचिपूर्ण आनुवंशिक उपकरणों, लघु प्रजनन के समय के लिए मूल्यवान है, और अत्यधिक आणविक और सेलुलर रास्ते संरक्षित किया गया। फल मक्खी सफलतापूर्वक बुनियादी संकेत दे रास्ते, बहुकोशिकीय जीवों की patterning तंत्र, साथ ही तंत्र न्यूरोनल विकास, कार्य अंतर्निहित, और रोगों 1,2 टुकड़े करना नियोजित किया गया है। सेल लेबलिंग और इमेजिंग तकनीक के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों के साथ, फल मक्खी के मस्तिष्क न्यूरोनल circuitry के ठीक मानचित्रण में और इस तरह सीखने और स्मृति, और circadian ताल 1,3 के रूप में उच्च मस्तिष्क कार्यों की आणविक और सेलुलर आधार विदारक में विशेष रूप से शक्तिशाली हो गया है, 4,5,6,7,8।
ड्रोसोफिला प्रणाली का एक विशेष लाभ अपने अपेक्षाकृत छोटे आकार, पूरे माउंट तैयारी और मस्तिष्क एक नियमित यौगिक या confocal खुर्दबीन का उपयोग की परीक्षा की अनुमति है। थीएस सुविधा इस प्रकार पूरे भीतर दोनों का अध्ययन विषय के लिए एक समग्र दृष्टिकोण और उसका सही ज्यामिति उपलब्ध कराने, एक पूरे के मस्तिष्क के ऊतकों के संदर्भ में neuronal circuitry की विस्तृत शारीरिक और कार्यात्मक विश्लेषण, या यहां तक कि एक न्यूरॉन, सेलुलर और subcellular स्तर पर सक्षम बनाता है, दिमाग। हालांकि, मस्तिष्क के बजाय लघु आकार को देखते हुए यह भी कुशलता से एक वयस्क मक्खी में सुरक्षात्मक बहिःकंकाल सिर मामले से बाहर एक अक्षुण्ण मस्तिष्क के ऊतकों विदारक में एक तकनीकी चुनौती प्रस्तुत करता है। विभिन्न प्रभावी और अपेक्षाकृत सरल विच्छेदन के तरीकों को विस्तार से वर्णन किया गया है, जो आम तौर पर सावधान शामिल है और कदम वार सिर मामले के हटाने और आंखों सहित जुड़े ऊतकों, श्वासनली, और वसा मस्तिष्क उचित 9, 10। ये microsurgical विच्छेदन तरीकों से अक्सर विच्छेदन संदंश की गुणवत्ता पर नहीं बल्कि कड़े मांगों जगह है, ठीक है अच्छी तरह से गठबंधन सुझाव दिए आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है के साथ संदंश पर निर्भर है। इसके अलावा, के रूप में विच्छेदित दिमाग अक्सर separat हैंशरीर के बाकी हिस्सों से एड, दिमाग को आसानी से, क्योंकि उनके छोटे आकार और प्रसंस्करण के बफर में उनकी पारदर्शिता के बाद धुंधला और कपड़े धोने की प्रक्रिया के दौरान खो दिया जा सकता है। यहाँ, हम वयस्क दिमाग कि विच्छेदित धड़ से जुड़ी दिमाग रहता है के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और आसान करने के लिए जानने के लिए, एक कदम विच्छेदन प्रोटोकॉल का वर्णन। विच्छेदन प्रक्रिया अक्सर आसानी से इस तरह आंख और श्वासनली के रूप में मस्तिष्क से जुड़े ऊतकों के सबसे दूर साफ करता है और अच्छी गुणवत्ता विच्छेदन संदंश के लिए मांग कम कर देता है।
इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट यौगिक सूक्ष्मदर्शी या confocal खुर्दबीन के नीचे ब्रेन इमेजिंग जब मस्तिष्क के पक्ष फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत से दूर है कि अक्सर एक कमजोर संकेत और कम स्पष्ट छवियों पूरे माउंट मस्तिष्क की मोटाई के कारण पैदा करता है। यहाँ, हम भी एक साधारण बढ़ते विधि है कि मस्तिष्क के नमूनों की आसान flipping की अनुमति देता है, इसी तरह के संकेत intensi साथ मस्तिष्क के दोनों पक्षों के सुविधाजनक इमेजिंग सक्षम वर्णनTy और गुणवत्ता।
वयस्क मस्तिष्क का अध्ययन करने के लिए इस विधि के आवेदन के लिए एक सबूत की अवधारणा के रूप में, हम आगे डब्ल्यू 1118 मक्खियों के दिमाग में न्यूरॉन्स महंगाई भत्ते की उपस्थिति की जांच की; एक जीनोटाइप है कि अक्सर ट्रांसजेनिक मक्खियों और कई ड्रोसोफिला अध्ययन में wildtype नियंत्रण पैदा करने के लिए माता-पिता की पंक्ति के रूप में इस्तेमाल किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव मस्तिष्क रोग, न्यूरोनल सर्किट, और उच्च मस्तिष्क कार्यों का अध्ययन करने के लिए वयस्क ड्रोसोफिला मस्तिष्क का प्रयोग करने में एक बढ़ती रुचि के साथ, यह पूरे माउंट विश्लेषण करती है, जो बड़े के लिए व?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस परियोजना के लिए उनकी अपार समर्थन के लिए श्री Enes Mehmet, सुश्री Kiara Andrade, सुश्री पिलर रोड्रिगेज, क्रिस क्वोक, और सुश्री Danna Ghafir स्वीकार करते हैं।
Materials
| w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
| PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
| NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
| D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
| Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
| Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
| Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
| Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
| Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
| Zen lite software | Quote |
Referências
- Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genética. 199, 639-653 (2015).
- Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
- Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
- Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
- Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
- Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
- Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
- Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
- Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
- Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson’s disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
- Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
