Summary

צעד-אחד פשוט פרוטוקול לנתיחה עבור כל הר הכנה למבוגרים<em> תסיסנית</em> Brains

Published: December 01, 2016
doi:

Summary

המוח תסיסנית הבוגרת הוא מערכת יקרה ללימוד מעגלים עצביים, תפקוד מוח גבוה, והפרעות מורכבות. שיטה יעילה כדי לנתח רקמות מוח כולו מראש הזבוב הקטן תקל מחקרים מבוססי מוח. כאן אנו מתארים פשוט, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב.

Abstract

יש עניין גובר בשימוש תסיסנית מודל מחלות ניווניות במוח האנושי, למפות circuitries עצביים במוח הבוגר, וללמוד את הבסיס המולקולרי הסלולר של תפקודי מוח גבוהים. תכשיר כל ההר של מוחות בוגרים עם מורפולוגיה השתמרה היטב הוא קריטי ללימודי מוח מבוסס כולו כזה, אבל יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ונדרש זמן רב. פרוטוקול זה מתאר גישת דיסקציה קלה ללמוד, צעד אחד של ראש זבוב בוגר תוך פחות מ -10 שניות, תוך שמירה במוח השלם מחובר לשאר הגוף כדי להקל מדרגות עיבוד שלאחר מכן. ההליך מסייע להסיר ביותר של רקמות העין לקנה הנשימה הקשורים בדרך כלל עם המוח שיכולים להפריע צעד הדמיה מאוחר יותר, וגם מציב פחות ביקוש על איכות מלקחיים לנתח. בנוסף, אנו מתארים שיטה פשוטה המאפשרת מרפרף נוח של דגימות מוח רכוב על coverslip, שהינה חשובה הדמיה משני צידי בגשמים בעצמה ואיכות אות דומות. כדוגמה של הפרוטוקול, אנו מציגים ניתוח של דופאמין (DA) נוירונים במוח הבוגר של WT (w 1118) זבובים. היעילות הגבוהה של השיטה לנתיחה עושה את זה שימושי במיוחד עבור מבוגר בקנה מידה גדולה מחקרי מוח מבוססים תסיסנית.

Introduction

האורגניזם המודל תסיסנית, הידוע בכינויו זבוב הפרות, כבר מוערך ארוך עבור הכלים הגנטיים האלגנטיים שלה, פעמי רבייה קצרות, ומאוד נשמר מסלולים מולקולריים תאיים. זבוב הפרות הועסק בהצלחה לנתח מסלולי איתות בסיסיים, מנגנוני הדפוסים של יצורים רבים-תאיים, כמו גם את מנגנוני התפתחות עצבית, פונקציות, ומחלות 1,2. עם התקדמות בטכנולוגיות תיוג הדמית תא, מוח זבוב פרות הפך חזק במיוחד במיפוי קנס של מעגלים עצביים לשלוף את הבסיס המולקולרי הסלולר של תפקודי מוח גבוהים, כגון למידה וזיכרון, וכן מקצב צירקדי 1,3, 4,5,6,7,8.

יתרון אחד מסוים של מערכת תסיסנית הוא גודלו הקטן יחסית, מה שמאפשר כל הר הכנה ובדיקה של המוח באמצעות תרכובת רגילה או מיקרוסקופ confocal. תיתכונה של אפשר ניתוחים אנטומיים מפורטים ופונקציונליים של מעגלים עצביים, או אפילו תא עצב יחיד, ברמות הסלולר subcellular, בהקשר של רקמות מוח כולו, ובכך לספק היא נקודת מבט הוליסטית של המטפלים בנושא והגיאומטריה המדויקת שלה בתוך המכלול מוֹחַ. עם זאת, בהתחשב בגודל מיניאטורי למדי של המוח, זה גם אתגר טכני לנתח רקמה במוח שלמה ביעילות מתוך תיק ראש השלד חיצוני המגן בתוך זבוב בוגר. יעיל שונה ופשוט יחסית שיטות לנתיחה תוארו בפירוט, אשר בדרך כלל כרוכות זהיר צעד חכם הסרה במקרה הראש ואת הרקמות הקשורות כוללות העיניים, קנה נשימה, שומן מהמוח 9 הראוי, 10. שיטות לנתיחת מייקרו אלה לעתים קרובות למקום יותר בדרישות המחמירות על איכות מלקחיים לנתיחה, בהסתמך על מלקחיים עם עצות גם מזדהות בסדר כי עלולים להיפגע בקלות. יתרה מזאת, כפי המוח הגזור הוא בדרך כלל בהסרהאד משאר הגוף, המוח יכול בקלות ללכת לאיבוד במהלך תהליכי המכתים והשטיפה עוקבים כי בעלי המידות הקטנות שלהם והשקיפות שלהם למאגר העיבוד. כאן, אנו מתארים פשוט יחסית וקל ללמוד, פרוטוקול לנתיחת צעד אחד עבור מוחות בוגרים שמחזיקים את המוח הגזור מצורף הטורסו. תהליך לנתיחה לעתים קרובות בקלות מנקה את רוב הרקמות הקשורים במוח כגון העין ואת קנה הנשימה ומקטין את הביקוש מלקחיים דיסקציה באיכות טובה.

בנוסף, כאשר הדמית המוח מתחת למיקרוסקופ מתחם הניאון או confocal, הצד של המוח כי הוא הרחק ממקור אור פלורסנט לעתים קרובות מייצר אות חלשה ותמונות פחות ברורות בשל העובי של המוח כל ההר. כאן אנו גם מתארים שיטת הרכבה פשוטה המאפשרת מרפרף קל של דגימות המוח, המאפשר הדמיה נוחה של שני הצדדים של המוח עם intensi אות הדומהty ואיכות.

כהוכחה של קונספט עבור היישום של השיטה בחקר המוח הבוגר, עוד בחנו את הנוכחות של נוירונים DA במוחם של w 1118 זבובים; גנוטיפ זה משמש לעתים קרובות כקו ההורי להפקת זבובים מהונדסים ואת שליטת wildtype במחקרים תסיסנית רבים.

Protocol

פתרונות 1. משמש המוח Dissection ו Immunofluorescent מכתים לנתח המבוגר לטוס המוח בנוזל השדרה מוחין מלאכותי (aCSF): 119 מ"מ NaCl, 26.2 מ"מ NaHCO 3, 2.5 מ"מ KCl, 1 מ"מ לאא 2 4 PO, 1.3 מ"מ MgCl 2, ו -10 גלוקוז מ"מ. לפני השימוש, ה?…

Representative Results

איור 1 מדגים את ההליכים העיקריים לנתיחה המוח הבוגר, כמתואר לעיל איורים 2 ו -3 הם תמונות נציג של 3 ימים בת WT. (גנוטיפ: w 1118) מבוגר לטוס המוח, שהיו costained עם נוגדן נגד טירוזין hydroxylase (TH צבעוני, באדום באיור 2 ולבן <st…

Discussion

עם עניין גובר בשימוש מוח תסיסנית מבוגר כדי לחקור מחלות מוח אנושיות, מעגלים עצביים, ועל תפקוד מוח גבוה, יש צורך לפתח שיטות פשוטות ומהירות להשיג מוח זבוב על תילן כל הר מנתח, אשר חשוב במיוחד עבור מידה גדולה סולם מסך מוחי. השיטה שלנו מספקת פשוט וקל ללמוד גישה לנתח את ר?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מכירים מר Enes מחמט, הגב 'קיארה אנדרדה, הגב' פילאר רודריגז, כריס קווק, והגב 'דנה Ghafir לתמיכה העצומה שלהם לפרויקט.

Materials

w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 Bloomington Drosophila Stock Center 51652 Balancer was switched to TM6B
PBac{WH}parkf01950 Exelixis at Harvard Medical School f01950 Balancer was switched to TM6C
NaCl Fisher Scientific S640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3 Fisher Scientific 02-003-990
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) Fisher Scientific 02-004-198
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific 02-003-265
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G Replaces glucose
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size Fisher Scientific GVWP14250
Formalin Solution, 10% (Histological) Fisher Scientific SF98-20
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent Fisher Scientific 02-003-823
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points Fisher Scientific 17-456-055 Protocol does not require very fine points. 
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Pel-Freez Biologicals P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav The Developmental Studies Hybridoma Bank Clone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate ThermoFisher Scientific A-21247
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific A-11037
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Propyl gallate powder Sigma-Aldrich P3130-100G
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% Sigma-Aldrich G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1 Zeiss Quote
Zeiss Apotome.2 Zeiss Quote
Zen lite software Quote

Referências

  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genética. 199, 639-653 (2015).
  2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
  3. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
  4. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
  5. Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
  6. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
  7. Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
  8. Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  11. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
  12. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
  13. Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
  14. Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
  15. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
  16. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
  17. Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson’s disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
  18. Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
check_url/pt/55128?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (118), e55128, doi:10.3791/55128 (2016).

View Video