Summary

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em> Drosophila</em> Brains

Published: December 01, 2016
doi:

Summary

De volwassen Drosophila hersenen waardevol voor de studie van neuronale circuits, hogere hersenfuncties, en complexe aandoeningen. Een efficiënte methode om hele hersenweefsel van de kleine vlieg hoofd ontleden zal brain-based studies vergemakkelijken. Hier beschrijven we een eenvoudige, een-stap dissectie protocol van volwassen hersenen met goed bewaard gebleven morfologie.

Abstract

Er is een toenemende belangstelling voor het gebruik Drosophila tot menselijke hersenen degeneratieve ziekten te modelleren, kaart neuronale circuits in volwassen hersenen, en de studie van de moleculaire en cellulaire basis van de hogere hersenfuncties. Een hele-mount voorbereiding van de volwassen hersenen met goed bewaarde morfologie is van cruciaal belang voor een dergelijke hersenen als geheel op basis van studies, maar kan technisch uitdagende en tijdrovend zijn. Dit protocol beschrijft een eenvoudig te leren, een stap dissectie aanpak van een volwassen vliegen kop in minder dan 10 s, terwijl de intacte hersenen aan de rest van het lichaam om verdere verwerkingsstappen vergemakkelijkt. De procedure helpt bij het verwijderen van de meeste oog en tracheale weefsels die normaal zijn voor de hersenen die kunnen interfereren met de latere beeldvormingsstap en plaatst ook minder eisen aan de kwaliteit van het ontleden tang. Daarnaast beschrijven we een eenvoudige methode die gemakkelijk omkeren van de gemonteerde hersenmonsters maakt op een dekglaasje, wat belangrijk is voor het afbeelden van beide zijden van de bregens met gelijke signaalintensiteit en kwaliteit. Als voorbeeld van het protocol, een analyse van dopaminerge (DA) neuronen presenteren we volwassen hersenen van WT (w 1118) vliegt. De hoge werkzaamheid van de dissectie methode maakt het bijzonder nuttig voor grootschalige volwassen hersenen-gebaseerde studies in Drosophila.

Introduction

De modelorganisme Drosophila, algemeen bekend als de fruitvlieg, is al lange tijd gewaardeerd om zijn elegante genetische instrumenten, korte reproductieve keer, en sterk geconserveerd moleculaire en cellulaire routes. De fruitvlieg is met succes toegepast om fundamentele signaalwegen, welke patroonvormende mechanismen van meercellige organismen, en de onderliggende mechanismen van neuronale ontwikkeling, functies en ziekten 1,2 ontleden. Met recente ontwikkelingen in cel labeling en beeldvormende technieken, heeft Fruitvlieghersenen bijzonder krachtig in fine mapping van neuronale circuits en het ontleden van de moleculaire en cellulaire basis van hogere hersenfuncties, zoals leren en geheugen, en circadiane ritme 1,3 worden, 4,5,6,7,8.

Een bijzonder voordeel van de Drosophila systeem is de relatief kleine omvang, waardoor whole-mount voorbereiding en onderzoek van de hersenen met behulp van een gewone verbinding of confocale microscoop. This functie maakt gedetailleerde anatomische en functionele analyse van neuronale circuits, wellicht slechts één neuron op cellulaire en subcellulaire niveaus, in de context van een hele hersenweefsel, waardoor zowel een holistische kijk op het onderzochte subject en de precieze geometrie in de hele hersenen. Echter, gezien de nogal miniatuur grootte van de hersenen, het presenteert ook een technische uitdaging in een intacte hersenweefsel efficiënt te ontleden uit de beschermende exoskelet hoofd geval in een volwassen vlieg. Verschillende effectieve en relatief eenvoudige dissectie werkwijzen zijn beschreven, die meestal betrekking voorzichtig en stapsgewijze verwijdering van de kop zaak en de omliggende weefsels zoals de ogen, de luchtpijp en vet van de hersenen juiste 9, 10. Deze microchirurgische dissectie methoden plaats vaak nogal strenge eisen aan de kwaliteit van de dissectie pincet, met een beroep op de tang met fijne goed uitgelijnd tips die gemakkelijk kunnen worden beschadigd. Bovendien, zoals de hersenen ontleed zijn vaak separated van de rest van het lichaam, kan de hersenen gemakkelijk verloren tijdens de daaropvolgende kleuring en wasprocessen vanwege hun kleine afmetingen en de transparantie bij de verwerking buffer. Hier beschrijven we een betrekkelijk eenvoudige en makkelijk te leren, éénfasige dissectie protocol voor volwassen hersenen die de hersenen ontleed aan de romp blijft. De dissectie proces is vaak gemakkelijk ruimt meeste van de hersenen weefsels zoals het oog en trachea en vermindert de vraag naar goede kwaliteit dissectie pincet.

Bovendien, bij beeldvorming van de hersenen onder de fluorescerende verbinding microscoop of confocale microscoop, de kant van de hersenen dat is verwijderd van de fluorescerende lichtbron levert vaak een zwakker signaal en minder heldere beelden doordat de dikte van de hele-mount hersenen. We beschrijven ook een eenvoudige montage methode die eenvoudig omkeren van de hersenmonsters toelaat, waardoor gemakkelijke beeldvorming aan beide zijden van de hersenen met gelijke signaal intensity en kwaliteit.

Als een proof-of-concept voor de toepassing van deze methode om de volwassen hersenen te bestuderen, we verder onderzocht op de aanwezigheid van DA neuronen in de hersenen van w 1118 vliegt; een genotype dat vaak wordt gebruikt als ouderlijn voor transgene vliegen en wildtype controle in vele studies Drosophila.

Protocol

1. Oplossingen Gebruikt voor Brain Dissection en immunofluorescentiekleuring Ontleden de volwassen hersenen vliegen kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2PO 4, 1,3 mM MgCl2 en 10 mM glucose. Voor gebruik gas de aCSF met 5% CO2 / 95% O2 gedurende 10 – 15 min en piek met 2,5 mM CaCl2. Steriliseer de aCSF oplossing door filtreren door een 0,22 urn membraanfilter. …

Representative Results

Figuur 1 illustreert de belangrijkste procedures voor volwassen hersenen dissectie, zoals hierboven beschreven figuren 2 en 3 zijn representatief afbeeldingen 3 dagen oude WT. (Genotype: w 1118) adulte hersenen, die werden costained met een antilichaam tegen tyrosine hydroxylase vlieg (TH , gekleurd in rood in figuur 2 en wit in figuur 3), een marker vaak gebruikt voor DA neuronen <su…

Discussion

Met een toenemend belang bij volwassen Drosophila hersenen menselijke hersenziekten, neuronale circuits en hogere hersenfuncties bestuderen, is het noodzakelijk om eenvoudig en snel te ontwikkelen tot intacte fly hersenen krijgen voor hele-mount analyses, wat vooral belangrijk voor grote- schalen brain-based schermen. Onze methode biedt een eenvoudige en makkelijk te leren aanpak te ontleden uit een vlieg hoofd (vaak in minder dan 10 s met ervaring) met goed bewaard gebleven morfologie, dat is grotendeels ontda…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij erkennen Mr Enes Mehmet, mevrouw Kiara Andrade, mevrouw Pilar Rodriguez, Chris Kwok, en mevrouw Danna Ghafir voor hun enorme steun aan het project.

Materials

w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 Bloomington Drosophila Stock Center 51652 Balancer was switched to TM6B
PBac{WH}parkf01950 Exelixis at Harvard Medical School f01950 Balancer was switched to TM6C
NaCl Fisher Scientific S640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3 Fisher Scientific 02-003-990
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) Fisher Scientific 02-004-198
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific 02-003-265
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G Replaces glucose
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size Fisher Scientific GVWP14250
Formalin Solution, 10% (Histological) Fisher Scientific SF98-20
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent Fisher Scientific 02-003-823
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points Fisher Scientific 17-456-055 Protocol does not require very fine points. 
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Pel-Freez Biologicals P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav The Developmental Studies Hybridoma Bank Clone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate ThermoFisher Scientific A-21247
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific A-11037
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Propyl gallate powder Sigma-Aldrich P3130-100G
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% Sigma-Aldrich G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1 Zeiss Quote
Zeiss Apotome.2 Zeiss Quote
Zen lite software Quote

Referências

  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genética. 199, 639-653 (2015).
  2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
  3. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
  4. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
  5. Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
  6. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
  7. Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
  8. Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  11. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
  12. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
  13. Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
  14. Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
  15. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
  16. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
  17. Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson’s disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
  18. Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
check_url/pt/55128?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (118), e55128, doi:10.3791/55128 (2016).

View Video