Summary

En simpel en-trin Dissektion Protokol for Whole-mount Forberedelse af Voksen<em> Drosophila</em> Brains

Published: December 01, 2016
doi:

Summary

Den voksne Drosophila hjerne er et værdifuldt system til at studere neuronal kredsløb, højere hjernefunktioner, og komplekse lidelser. En effektiv metode til at dissekere hele hjernevæv fra den lille flue hoved vil lette hjerne-baserede undersøgelser. Her beskriver vi en enkel, et-trins dissektion protokol af voksne hjerner med velbevaret morfologi.

Abstract

Der er en stigende interesse i at bruge Drosophila at modellere menneskelige hjerne degenerative sygdomme, kort neuronale kredsløbssystemer hos voksne hjerner, og studere det molekylære og cellulære grundlag af højere hjernefunktioner. En hel-mount forberedelse af voksne hjerner med velbevaret morfologi er afgørende for sådanne hele hjernen-baserede undersøgelser, men kan være teknisk udfordrende og tidskrævende. Denne protokol beskriver en nem at lære, et-trins dissektion tilgang af en voksen flue hoved på mindre end 10 s, medens den intakte hjerne er fæstnet til resten af ​​kroppen for at lette efterfølgende forarbejdningstrin. Proceduren hjælper med at fjerne de fleste af øjet og trakeale væv normalt er forbundet med hjernen, der kan forstyrre den senere billedbehandling trin, og placerer også mindre krav til kvaliteten af ​​de dissekere pincet. Derudover beskriver vi en simpel metode, der tillader bekvem flipping af de monterede hjerneprøver på et dækglas, hvilket er vigtigt til afbildning begge sider af bregnskyl med lignende signal intensitet og kvalitet. Som et eksempel på protokollen, vi fremlægge en analyse af dopaminerge (DA) neuroner i voksne hjerner WT (w 1118) fluer. Den høje effektivitet af dissektion metode gør det især nyttigt for store voksne hjerne-baserede studier i Drosophila.

Introduction

Modellen organisme Drosophila, almindeligvis kendt som bananfluen, har længe været værdsat for sine elegante genetiske værktøjer, korte reproduktive gange, og stærkt bevaret molekylære og cellulære veje. Bananfluen er blevet anvendt med held til at dissekere grundlæggende signalveje, mønstret mekanismer flercellede organismer, såvel som mekanismerne bag neuronal udvikling, funktioner og sygdomme 1,2. Med de seneste fremskridt inden for celle mærkning og imaging teknologier, har bananfluen hjernen bliver særligt effektiv i fin kortlægning af neuronal kredsløb og i at dissekere den molekylære og cellulære grundlag af højere hjernefunktioner, såsom indlæring og hukommelse, og døgnrytme 1,3, 4,5,6,7,8.

En særlig fordel ved Drosophila-systemet er dets relativt lille størrelse, hvilket tillader hel-mount fremstilling og undersøgelse af hjernen under anvendelse af en almindelig forbindelse eller konfokal mikroskop. This funktion giver detaljerede anatomiske og funktionelle analyser af neuronal kredsløb, eller endda en enkelt neuron, ved cellulære og subcellulære niveauer, i forbindelse med en hel hjernevæv, hvilket giver både et holistisk syn på den undersøgte genstand og dens præcise geometri i hele hjerne. Men i betragtning af den temmelig miniature størrelse af hjernen, præsenterer det også en teknisk udfordring i effektivt dissekere en intakt hjernevæv ud af den beskyttende exoskeleton hoved sagen i en voksen flue. Forskellige effektive og relativt simple dissektion metoder er blevet beskrevet i detaljer, som normalt involverer omhyggelig og trinvis fjernelse af hovedet sagen og de tilknyttede væv, herunder øjnene, luftrør, og fedt fra hjernen ordentlig 9, 10. Disse mikrokirurgiske dissektionsmetode Placer ofte ret strenge krav til kvaliteten af ​​de dissektion pincet, bygger på pincet med fine godt alliancefrie tips, der let kan beskadiges. Da de dissekerede hjerner ofte separatelyed fra resten af ​​kroppen, kan hjerner let tabt under de efterfølgende farvning og vaskeprocesser grund af deres små størrelser og deres gennemsigtighed i behandlingen buffer. Her beskriver vi en relativt simpel og nem at lære, et-trins dissektion protokol for voksne hjerner, der holder de dissekerede hjerner knyttet til torsoen. Den dissektion proces ofte let rydder væk de fleste af hjernen-associerede væv, såsom øjet og luftrøret og reducerer behovet for god kvalitet dissektion pincet.

Derudover, når billeddannelse af hjernen under fluorescerende forbindelse mikroskop eller konfokalt mikroskop, den side af hjernen, der er væk fra den fluorescerende lyskilde frembringer ofte et svagere signal og mindre klare billeder på grund af tykkelsen af ​​hele-mount hjernen. Her beskriver vi også en enkel montering metode, der muliggør let flipping af hjerneprøver, hvilket muliggør bekvem billeddannelse af begge sider af hjernen med lignende signal intensiveretty og kvalitet.

Som en proof-of-concept for anvendelsen af denne metode til at studere den voksne hjerne, vi yderligere undersøgt tilstedeværelsen af DA neuroner i hjernen på w 1118 fluer; en genotype, som ofte anvendes som den parentale linje til generering af transgene fluer og vildtype kontrol i mange Drosophila undersøgelser.

Protocol

1. Løsninger Bruges til Brain Dissektion og immunfluorescensfarvning Dissekere voksen flyve hjerner i kunstig cerebral spinalvæske (aCSF): 119 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO3, 2,5 mM KCI, 1 mM NaH 2 PO4, 1,3 mM MgCl2, og 10 mM glucose. Før brug gas i aCSF med 5% CO2 / 95% O 2 for 10 – 15 min og spike med 2,5 mM CaCl2. Steriliser aCSF opløsningen ved filtrering gennem et 0,22 um membranfilter. Bemærk: Opbevar aCSF…

Representative Results

Figur 1 illustrerer de vigtigste procedurer for voksne hjerne dissektion, som beskrevet ovenfor figur 2 og 3 er repræsentative billeder af 3 dage gamle WT. (Genotype: w 1118) voksen flyve hjerner, som blev costained med et antistof mod tyrosin hydroxylase (TH , farvet røde i figur 2 og hvid i figur 3), en markør der almindeligvis anvendes til at mærke DA neuroner 11, fo…

Discussion

Med en stigende interesse i at bruge voksne Drosophila hjernen til at studere humane hjernesygdomme, neuronal kredsløb og højere hjernefunktioner, er det nødvendigt at udvikle enkle og hurtige metoder til at opnå intakte flyve hjerner for hel-mount analyser, hvilket er særligt vigtigt for stor- skalere hjerne-baserede skærme. Vores metode giver en enkel og nem at lære tilgang at dissekere en flue hoved (ofte på mindre end 10 s med erfaring) med velbevaret morfologi, der er i høj grad ryddet for tilknyt…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkender Mr. Enes Mehmet, Ms Kiara Andrade, Ms Pilar Rodriguez, Chris Kwok, og Ms. Danna Ghafir for deres enorme støtte til projektet.

Materials

w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 Bloomington Drosophila Stock Center 51652 Balancer was switched to TM6B
PBac{WH}parkf01950 Exelixis at Harvard Medical School f01950 Balancer was switched to TM6C
NaCl Fisher Scientific S640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3 Fisher Scientific 02-003-990
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) Fisher Scientific 02-004-198
Magnesium Chloride (MgCl2) Fisher Scientific 02-003-265
D-Sorbitol Sigma-Aldrich S1876-500G Replaces glucose
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size Fisher Scientific GVWP14250
Formalin Solution, 10% (Histological) Fisher Scientific SF98-20
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent Fisher Scientific 02-003-823
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points Fisher Scientific 17-456-055 Protocol does not require very fine points. 
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody Pel-Freez Biologicals P40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav The Developmental Studies Hybridoma Bank Clone 7E8A10
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate ThermoFisher Scientific A-21247
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific A-11037
DAPI Solution (1 mg/mL) ThermoFisher Scientific 62248
Propyl gallate powder Sigma-Aldrich P3130-100G
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% Sigma-Aldrich G7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1 Zeiss Quote
Zeiss Apotome.2 Zeiss Quote
Zen lite software Quote

Referências

  1. Wangler, M. F., Yamamoto, S., Bellen, H. J. Fruit flies in biomedical research. Genética. 199, 639-653 (2015).
  2. Bellen, H. J., Yamamoto, S. Morgan’s legacy: fruit flies and the functional annotation of conserved genes. Cell. 163, 12-14 (2015).
  3. Aso, Y., et al. The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning. Elife. 3, 04577 (2014).
  4. Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11, 1114-1125 (2001).
  5. Yamagata, N., et al. Distinct dopamine neurons mediate reward signals for short- and long-term memories. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 578-583 (2015).
  6. Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 2967-2976 (2015).
  7. Waddell, S. Neural Plasticity: Dopamine Tunes the Mushroom Body Output Network. Curr Biol. 26, 109-112 (2016).
  8. Wolff, T., Iyer, N. A., Rubin, G. M. Neuroarchitecture and neuroanatomy of the Drosophila central complex: A GAL4-based dissection of protocerebral bridge neurons and circuits. J Comp Neurol. 523, 997-1037 (2015).
  9. Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harb Protoc. 2011, 1472-1474 (2011).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
  11. Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
  12. White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
  13. Yang, Y., et al. Mitochondrial pathology and muscle and dopaminergic neuron degeneration caused by inactivation of Drosophila Pink1 is rescued by Parkin. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 10793-10798 (2006).
  14. Greene, J. C., et al. Mitochondrial pathology and apoptotic muscle degeneration in Drosophila parkin mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4078-4083 (2003).
  15. Whitworth, A. J., et al. Increased glutathione S-transferase activity rescues dopaminergic neuron loss in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8024-8029 (2005).
  16. Pesah, Y., et al. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131, 2183-2194 (2004).
  17. Trinh, K., et al. Decaffeinated coffee and nicotine-free tobacco provide neuroprotection in Drosophila models of Parkinson’s disease through an NRF2-dependent mechanism. J Neurosci. 30, 5525-5532 (2010).
  18. Kim, K., Kim, S. H., Kim, J., Kim, H., Yim, J. Glutathione s-transferase omega 1 activity is sufficient to suppress neurodegeneration in a Drosophila model of Parkinson disease. J Biol Chem. 287, 6628-6641 (2012).
check_url/pt/55128?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J. Vis. Exp. (118), e55128, doi:10.3791/55128 (2016).

View Video