Isolamento rapido di BMPR-IB + derivate da tessuto adiposo cellule stromali per l'uso in un cranica difetto di guarigione Modello
Summary
Adipose-derived stromal cells may be useful for engineering new tissue from a patient’s own cells. We present a protocol for the isolation of a subpopulation of human adipose-derived stromal cells (ASCs) with increased osteogenic potential, followed by application of the cells in an in vivo calvarial healing assay.
Abstract
Invasive cancers, major injuries, and infection can cause bone defects that are too large to be reconstructed with preexisting bone from the patient’s own body. The ability to grow bone de novo using a patient’s own cells would allow bony defects to be filled with adequate tissue without the morbidity of harvesting native bone. There is interest in the use of adipose-derived stromal cells (ASCs) as a source for tissue engineering because these are obtained from an abundant source: the patient’s own adipose tissue. However, ASCs are a heterogeneous population and some subpopulations may be more effective in this application than others. Isolation of the most osteogenic population of ASCs could improve the efficiency and effectiveness of a bone engineering process. In this protocol, ASCs are obtained from subcutaneous fat tissue from a human donor. The subpopulation of ASCs expressing the marker BMPR-IB is isolated using FACS. These cells are then applied to an in vivo calvarial defect healing assay and are found to have improved osteogenic regenerative potential compared with unsorted cells.
Introduction
I principali difetti ossei derivanti da lesioni, infezioni o cancro invasivo hanno un impatto significativo sul recupero e la qualità della vita del paziente. Le tecniche esistono per riempire questi difetti con ossa sane da altrove nel corpo del paziente, ma questo trasferimento porta proprio la morbilità e il rischio di complicazioni 1, 2, 3. Inoltre, alcuni difetti sono così grandi o complessi che sufficiente osso donatore non è disponibile per riempire il difetto. Dispositivi protesici sono una possibile opzione per il riempimento di difetti ossei, ma questi sono associati con diversi svantaggi, tra cui il rischio di infezione, guasti hardware, e la reazione da corpo estraneo 4.
Per questi motivi è grande interesse per la possibilità di ingegneria sostituti ossei biologici utilizzando cellule 5 del paziente. cellule stromali derivate da tessuto adiposo (ASC)hanno un potenziale per questa applicazione perché sono abbondantemente disponibili in proprio tessuto adiposo del paziente e hanno dimostrato la capacità di guarire difetti ossei generando nuovo tessuto osseo 6, 7. ASC sono una popolazione eterogenea di cellule e diversi studi hanno dimostrato che la selezione per specifici marcatori di superficie delle cellule in grado di produrre popolazioni di cellule con una maggiore attività osteogenica 8, 9. Selezione ASC con il più alto potenziale osteogenico aumenterebbe la probabilità che uno scaffold seminati con queste cellule potrebbe rigenerare un grande difetto osseo.
Proteina ossea morfogenetica (BMP) segnalazione è critica nel regolare differenziazione ossea e la formazione 10 e il tipo BMP Receptor IB (BMPR-IB) è noto per essere importante per osteogenesi in ASC 11. Recentemente, abbiamo dimostrato che l'espressione di BMPR-IB può be consente di selezionare per le ASC con una maggiore attività osteogenica 12. Qui mostriamo un protocollo per l'isolamento di BMPR-IB-esprimendo ASC dal grasso umano seguita da un saggio della loro attività osteogenica utilizzando un vivo cranica modello di difetto.
Protocol
Representative Results
Discussion
I passaggi critici all'interno del protocollo
Durante la raccolta di ASC, la fase critica è adeguata digestione dei grassi con collagenasi. digestione inadeguata si tradurrà in una bassa resa di ASC. Durante FACS ordinamento delle cellule BMPR-IB +, è importante definire con precisione il cancello per positività. Definire cancelli troppo debolmente può causare popolazioni ordinati che non sono puri. Durante la creazione del difetto cranica, è fondamentale per perforare il difetto attr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.D.M. was supported by the American College of Surgeons (ACS) Resident Research Scholarship. M.S.H. was supported by the California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Clinical Fellow training grant TG2-01159. M.S.H., H.P.L., and M.T.L. were supported by the American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. was supported by NIH grant R01 GM087609 and a gift from Ingrid Lai and Bill Shu in honor of Anthony Shu. H.P.L. and M.T.L. were supported by the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine and The Oak Foundation. M.T.L. was supported by NIH grants U01 HL099776, R01 DE021683-01, and RC2 DE020771. D.C.W. was supported by NIH grant 1K08DE024269, the Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, and the Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.
Materials
| 100 micron cell strainer | Falcon | 352360 | |
| 15 blade scalpel | Miltex | 4-515 | |
| 24 well plate | Corning | 3524 | |
| 40 micron cell strainer | Falcon | 352340 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-0 Ethilon nylon suture, 18", P-3 needle, | Ethicon | 1698G | |
| Anti-BMPR-IB primary antibody | R&D systems | FAB5051A | |
| BioGel PI surgical gloves | Mölnlycke Health Care | ALA42675Z | |
| Buprenorphine SR | ZooPharm | ||
| Castro-Viejo needle driver | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| CD1 nude mouse | Charles River | 086 | |
| Collagenase Type II powder | Gibco | 17101-015 | |
| DMEM medium | Gibco | 10564-011 | |
| Drill: Circular knife 4.0 mm | Xemax Surgical | CK40 | |
| Drill: Z500 Brushless Micromotor | NSK | NSKZ500 | |
| FBS | Gicbo | 10437-077 | |
| Fisherbrand Absorbent Underpads, 20" x 24" | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Fisherbrand Sterile cotton gauze pad, 4" x 4" | Fisher Scientific | 22-415-469 | |
| Heating pad | Kent Scientific | DCT-20 | |
| Hyclone 199/EBSS medium | GE Life Sciences | SH30253.01 | |
| Isothesia isoflurane | Henry Schein | 050033 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Micro Forceps with teeth | Roboz | RS-5150 | |
| Paraffin film (Parafilm) | Bemis | PM996 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140-122 | |
| PLGA scaffolds | Proprietary Formulation | ||
| Poloxamer 188, 10% | Sigma | P5556-100ML | |
| Polylined Sterile Field, 18" x 24" | Busse Hospital Disposables | 696 | Cut a rectangular hole of the appropriate size |
| Polysucrose Solution: Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | |
| Povidone Iodine Prep Solution | Medline | MDS093944H | |
| Puralube petrolatum ophthalmic ointment, 1/8 oz. tube | Dechra Veterinary Products | ||
| RBC lysis buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Webcol alcohol prep swabs | Covidien | 6818 |
Referências
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