Kapillær elektroforese Adskillelse af monoklonalt antistof Isoformer med en neutral kapillær
Summary
Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Abstract
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Introduction
Monoklonale antistoffer (mAb'er) er bioterapeutiske proteiner med stigende interesse på grund af deres evne til at handle mod flere kroniske og degenerative sygdomme 1. Ligesom andre biomolekyler, mAb'er er tilbøjelige til at undergå flere fysisk-kemiske modifikationer på alle stadier af deres livscyklus (dvs. fra biosyntese til det endelige produkt). Sådanne modifikationer indbefatter, men er ikke begrænset til: deamidering, glycosylering, oxidation, cyklisering, isomerisering, aggregering og proteolytisk spaltning 2. Derfor er analyseteknikker stand til at løse iboende isoformer nødvendige for at overvåge mAb'er heterogenitet og stabilitet for at etablere kvalitetsspecifikationer.
Kapillarelektroforese (CE) er en højtydende separationsteknologi bæres outinside af en smal kvartsglas rør (um) fyldt med en baggrund elektrolyt (BGE). Ved påføring af et elektrisk felt (op til 30.000 V), ladet molekyles migrere til elektroden med modsat ladning (dvs. elektro-drevet separation). Anvendelsen af høje spændinger i CE tillader hurtige analyser og øget effektivitet, som er overlegen i forhold til klassiske gelelektroforese. Kapillær zone elektroforese (CZE) er et CE-baserede teknik rutinemæssigt anvendes i den biofarmaceutiske industri til vurdering produktkvalitet 3-9. I modsætning til andre former for CE (f.eks kapillær gelelektroforese, kapillær isoelektrisk fokusering) eller kromatografi-baserede metoder, kan CZE udføres uden anvendelse af denatureringsmidler eller fast-fase-grænseflader, hvilket muliggør analysen af den iboende heterogenitet mAb'er tæt på deres native tilstand 10 . CZE adskillelse af mAb-isoformer opstår inde i en kvartsglas kapillar dækket med en hydrofil polymer (neutral kapillær) og er baseret på deres forskellige elektroforetiske mobilitet, som er styret af ladning, masse, størrelse og form (eller hydrodynamisk volumen) 11. detekteres mAb-dele, nårde mobiliseres og passere gennem påvisning vinduet, som registreres af en ultraviolet (UV) absorbans detektor ved 214 nm 4.
Den vellykkede gennemførelse af denne analyseteknik vil afhænge af behørig opmærksomhed på detaljer før og under forsøget. Handler ellers vil øge omkostningerne og tid til at udføre analysen, i sidste ende fører til konstant fiasko og frustration.
Her præsenterer vi en trin-for-trin guide til at gennemføre en vellykket analyse af mAb heterogenitet ved CZE gennem detaljeret forklaring af fremstilling af opløsninger og prøver, udarbejdelse af CE-systemet, instrumentets metoder, der er op, datafangst, og forarbejdningen. Med henblik på denne gennemgang, et rekombinant fuldt humant anti-tumornekrosefaktor-alfa (anti-TNFa) mAb anvendes som protein model; dog kan denne protokol kan let tilpasses til analyse af andre proteiner overvejer korte modifikationer. ENdditionally, flere anbefalinger afbøde foreslås potentielle problemer. Læseren opfordres til nøje at følge den foreslåede protokol, som sandsynligheden for at lykkes, vil stige.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne tutorial, fremhæver vi vigtigheden af ordentlig praksis, når der udføres CZE analyser af mAbs for at øge sandsynligheden for at lykkes. Men når CZE bruges rutinemæssigt, opstår, spørgsmål uundgåeligt 12.
For de bedste resultater, er det vigtigt at følge de toner, der var inkluderet i hele protokollen, da de vil hjælpe analytikeren til at overvinde og fejlfinding vanskelige skridt. En vigtig overvejelse for at opnå optimale opløsning på et givent sæt a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Materials
| Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
| ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
| (Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
| 6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
| eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
| eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
| Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
| Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
| Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
Referências
- Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases. Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).
- Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).
- Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis. Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).
- Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).
- He, Y., et al. Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column. Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).
- He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary. J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).
- Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics. Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).
- Štěpánová, S., Kašička, V. Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods. J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).
- Štěpánová, S., Kašička, V. Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins. Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).
- Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
- Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. Intact protein analysis in the biopharmaceutical field. J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).
- Altria, K. D., Altria, K. D. Troubleshooting. Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications. , (1996).
- Ma, S., Nashabeh, W. Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis. Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).
- Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital. Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).
