الشعرية الكهربائي فصل حيدة النسيلة الأجسام المضادة الإسوية باستخدام الشعرية محايد
Summary
Here, we present a comprehensive capillary zone electrophoresis protocol for the assessment of intrinsic physicochemical heterogeneity of monoclonal antibodies as a quality attribute.
Abstract
Biotherapeutic proteins, such as monoclonal antibodies (mAbs), are feasible alternatives for the treatment of chronic-degenerative diseases. The biological activity of these proteins depends on their physicochemical properties. The use of high-performance techniques like chromatography and capillary electrophoresis has been described for the analysis of physicochemical heterogeneity of mAbs. Nowadays, capillary zone electrophoresis (CZE) technique constitutes one of the most resolutive and sensitive assays for the analysis of biomolecules. Besides, the electro-driven separation in CZE is governed by extensive properties of matter and offers the advantage of analyzing proteins close to their native state. However, the successful implementation of this technique for routine analysis depends on the skills of the analyst at the critical steps during sample and system preparation. The purpose of this tutorial is to detail the steps to succeed in the CZE analysis of mAbs. Further, this protocol can be used for the development and improvement of skills of the personnel involved in protein analytical chemistry laboratories.
Introduction
الاجسام المضادة (MABS) هي بروتينات biotherapeutic مع تزايد الاهتمام نظرا لقدرتها على التحرك ضد العديد من الأمراض المزمنة والتنكسية 1. مثل الجزيئات الحيوية الأخرى، MABS عرضة للخضوع العديد من التعديلات الفيزيائية في جميع مراحل دورة حياتها (أي، من الحيوي إلى المنتج النهائي). وتشمل هذه التعديلات، ولكن لا تقتصر على: نزع الأميد، بالغليكوزيل، والأكسدة، cyclization، المماكبة، وتجميع والانقسام بروتين 2. وبالتالي، هناك حاجة إلى تقنيات تحليلية قادرة على حل الإسوية الجوهرية لمراقبة MABS عدم التجانس والاستقرار من أجل وضع مواصفات الجودة.
الشعرية الكهربائي (م) هو تقنية فصل عالية الأداء التي تقوم outinside من أنبوب تنصهر السيليكا الضيق (مجموعة ميكرون) مليئة بالكهرباء الخلفية (BGE). بناء على طلب من مجال كهربائي (تصل إلى 30،000 V)، جزيء مشحونةالصورة الهجرة نحو القطب مع المسؤول المعاكس (أي مدفوعة الكهربائية الفصل). استخدام الفولتية العالية في CE يسمح التحاليل السريعة وزيادة الكفاءة، والتي تعلو على الكهربائي للهلام الكلاسيكية. الكهربائي منطقة الشعرية (تشيكيا) هو أسلوب قائم على CE تستخدم بشكل روتيني في صناعة الأدوية الحيوية لتقييم جودة المنتج 3-9. وخلافا لغيرها من وسائط CE (على سبيل المثال، هلام الشعرية الكهربائي، الشعرية ISOELECTRIC التركيز) أو أساليب تعتمد على اللوني، ويمكن إجراء تشيكيا دون استخدام denaturants أو واجهات الحالة الصلبة، والسماح للتحليل التباين المتأصل في MABS قريبة من الدولة الأصلية الخاصة بهم 10 . الفصل تشيكيا من الأشكال الإسوية ماب يحدث داخل الشعرية تنصهر السيليكا مغطاة ماء البوليمر (الشعرية محايد) ويقوم على التنقل الكهربي مختلفة، والتي يحكمها تهمة والكتلة والحجم والشكل (أو حجم الهيدروديناميكية) 11. تم الكشف عن الأنصاف ماب عندمافهي تتحرك وتمر عبر نافذة الكشف، التي لمست من قبل كاشف الأشعة فوق البنفسجية (UV) الامتصاصية في 214 نانومتر (4).
والتنفيذ الناجح لهذه التقنية التحليلية يعتمد على الاهتمام المناسب لتفاصيل قبل وأثناء التجربة. يتصرف خلاف ذلك سيزيد من التكلفة والوقت لإجراء التحليل، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى الفشل المستمر والإحباط.
هنا، نقدم دليل خطوة بخطوة لإجراء تحليل الناجح لماب عدم التجانس التي كتبها تشيكيا من خلال شرح مفصل لتحضير محاليل والعينات، وإعداد نظام CE، أساليب أداة إعداد، والحصول على البيانات، و تجهيز. لغرض هذا البرنامج التعليمي، المؤتلف الإنسان بالكامل ألفا المضادة للعامل نخر الورم يستخدم (مكافحة TNFα) ماب كنموذج البروتين. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تخصيصها بسهولة لتحليل البروتينات الأخرى التي تفكر في التعديلات وجيزة. اdditionally، يقترح المشاكل المحتملة عدة توصيات للتخفيف. ومما يشجع القارئ على تتبع بدقة البروتوكول المقترح، واحتمال أن تنجح سوف تزيد.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذا البرنامج التعليمي، وتسليط الضوء على أهمية الممارسات السليمة عندما يحلل إجراء تشيكيا من MABS من أجل زيادة احتمال أن تنجح. ومع ذلك، عند استخدام تشيكيا على أساس روتيني، تنشأ قضايا لا محالة 12.
للحصول على أفضل النتائج، من ا?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Wiley for the granted permission to use the concepts of the following publication for this tutorial. Carlos E. Espinosa-de la Garza, Francisco C. Perdomo-Abúndez, Jesús Padilla-Calderón, Jaime M. Uribe-Wiechers, Néstor O. Pérez, Luis F. Flores-Ortiz, Emilio Medina-Rivero: Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 2013. 34. 1133-1140. Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. This work was supported by CONACyT, Mexico, grant 230551.
Materials
| Glacial acetic acid | Tecsiquim | AT0035-7 |
| ACS grade hydrochloric acid | J.T. Baker | 9535-05 |
| Histamine dihydrochloride | Fluka | 53300 |
| (Hydroxypropyl) methyl cellulose | Fluka | 09963 |
| Lithium acetate | Sigma-Aldrich | 517992 |
| 6-Aminocaproic acid | Sigma-Aldrich | A2504 |
| eCAP Tris Buffer, 50.0 mM, pH 8 | Beckman Coulter | 477427 |
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis System | Beckman Coulter | A66528 |
| eCAP Neutral capillary | Beckman Coulter | 477441 |
| Vial, Micro, 200 µl | Beckman Coulter | 144709 |
| Universal Vial Caps | Beckman Coulter | A62250 |
| Universal Vials | Beckman Coulter | A62251 |
| Cable, Optics, UV/Vis | Beckman Coulter | 144093 |
| UV/Vis Detector Module | Beckman Coulter | 144733 |
| Cartridge Assembly Kit, Blank | Beckman Coulter | 144738 |
Referências
- Bruno, V., Battaglia, G., Nicoletti, F. The advent of monoclonal antibodies in the treatment of chronic autoimmune diseases. Neurol. Sci. 31, 283-288 (2011).
- Liu, H., Gaza-Bulseco, G., Faldu, D., Chumsae, C., Sun, J. Heterogeneity of monoclonal antibodies. J. Pharm. Sci. 97 (7), 2426-2447 (2008).
- Creamer, J. S., Oborny, N. J., Lunte, S. M. Recent advances in the analysis of therapeutic proteins by capillary and microchip electrophoresis. Anal. Methods. 6 (15), 5427-5449 (2014).
- Fekete, S., Guillarme, D., Sandra, P., Sandra, K. Chromatographic, Electrophoretic, and Mass Spectrometric Methods for the Analytical Characterization of Protein Biopharmaceuticals. Anal. Chem. 88 (1), 480-507 (2016).
- He, Y., et al. Analysis of identity, charge variants, and disulfide isomers of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in an uncoated capillary column. Anal. Chem. 82 (8), 3222-3230 (2010).
- He, Y., Isele, C., Hu, W., Ruesch, M. Rapid analysis of charge variants of monoclonal antibodies with capillary zone electrophoresis in dynamically coated fused-silica capillary. J. Sep. Sci. 34 (5), 548-555 (2011).
- Zhao, S. S., Chen, D. D. Y. Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics. Electrophoresis. 35 (1), 96-108 (2014).
- Štěpánová, S., Kašička, V. Determination of impurities and counterions of pharmaceuticals by capillary electromigration methods. J. Sep. Sci. 37 (15), 2039-2055 (2014).
- Štěpánová, S., Kašička, V. Recent applications of capillary electromigration methods to separation and analysis of proteins. Anal. Chim. Acta. 933, 23-42 (2016).
- Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
- Staub, A., Guillarme, D., Schappler, J., Veuthey, J. L., Rudaz, S. Intact protein analysis in the biopharmaceutical field. J. Pharm. Biomed. Anal. 55 (4), 810-822 (2011).
- Altria, K. D., Altria, K. D. Troubleshooting. Methods in Molecular Biology, Vol 52. Capillary Electrophoresis Guidebook: Principles, Operation and Applications. , (1996).
- Ma, S., Nashabeh, W. Analysis of protein therapeutics by capillary electrophoresis. Chromatographia. 53 (5), 75-89 (2001).
- Jaccoulet, E., Smadja, C., Prognon, P., Taverna, M. Capillary electrophoresis for rapid identification of monoclonal antibodies for routine application in hospital. Electrophoresis. 36 (17), 2050-2056 (2015).
