Yumuşak agar üst tabaka tekniği kullanımı bakteriyel olarak üretilmiş önleyici bileşiklerin taranması için
Summary
We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.
Abstract
yumuşak agar bindirme tekniği aslında 70 yıl önce geliştirilmiş ve yaygın olarak bakteriyofajların ve bakteriyosinlere, proteinli antibakteriyel ajanlar ile çalışmak da dahil olmak üzere mikrobiyolojik araştırmalar birkaç alanlarda kullanılmaktadır. Bu yaklaşım en az kaynak gereksinimleri ile, nispeten ucuzdur. Bu teknik, (toksik bir bileşik (ler) e potansiyel olarak hassas) bakteriyel test türünün tohumlanır katılaştırılmış yumuşak agar bindirme üzerinde (ve potansiyel olarak toksik bileşik (ler) barındıran) bir verici suşundan süpernatan tespit oluşur. Biz Pseudomonas syringae bir kütüphane intraspecific öldürülmesi için suşlarının taranması için bu tekniği kullanılmıştır. bir çökeltme aşaması ve hedeflenen gen delesyonlu bu yaklaşımı birleştirerek, aynı suşu tarafından üretilen çok sayıda toksik bileşikler ayrıştırılabilir. genellikle bu tekniği kullanarak kurtarılan iki karşıt ajanlar bakteriyofajlar ve bakteriyosinler vardır. Bu iki ajan kullanılarak ayırt edilebiliriki basit ek testler. bakteriyofaj içeren bir süpernatan bir seri seyreltme yapılarak, daha fazla seyreltme ile orantılı az hale tek tek plaklar neden olur, oysa daha yüksek seyreltme üniform daha bulanık olan bir temizleme bölgesine neden olur bakteriyosin ihtiva eden bir yüzer seri dilüsyon. bakteriyosin seyreltme sayesinde taze yumuşak agar çim transfer zaman bakteriyosin bir temizleme bölgesini üretmeyecektir ise, aynı suşu ile tohumlanır taze yumuşak agar bindirme üzerine noktalar Ayrıca, bir bakteriyofaj bir temizleme bölgesi üretir.
Introduction
Son zamanlarda, antibiyotiğe dirençli patojenlerin 1,2 mücadelede kullanmak için mikrobiyal ekoloji anlayışı (çeşitli ortamlarda özellikle microbiomes) yanı sıra, yeni antibakteriyel bileşikler derinleştirilmesi önemli ilgi olmuştur. Bu çıkarları arasında bir ara bağlantı teması doğal ortamda bakteri türleri arasında uzlaşmaz etkileşimleri anlamaktır. Bakteri rakipleri 3 antagonize ettiği sayısız yolu vardır. Bakteriyosinler, proteinli, antibakteriyel bileşiklerin çeşitli bir grup, uzun Pseudomonas aeruginosa 4,5 ve Escherichia coli 6, önemli insan patojenleri olmanın en çok çalışılan türlerin ikisi ile, interbacterial antagonizma aracılık rolleri nedeniyle çalışılmıştır. Bakteriyosinlerin ek olarak, indüklenen prophages da soyu önceden 7 kolonize olan bir niş işgal sağlayan anticompetitor maddeler olarak işlev görebilir. Pseudomonas syringae tek bir protein bakteriyosinlerin 8, bakteriyofaj kuyruk türetilmiş bakteriyosinlerin 9 (adlandırılır tailocins), hem de non-protein ikincil metabolitlerin 10 de dahil olmak üzere antimikrobiyal maddeler, bir dizi üretmek için bilinen bir bitki patojendir. Son zamanlarda bu antimikrobiyaller onlar bitki hastalığı 11 kontrol olmak üzere kullanılabilecek nasıl yanı sıra, bu organizmanın ekolojisini nasıl etkilediğini anlamada ilgi olmuştur.
bakteriyosinler ve bakteriyofaj hem araştırılması için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, yumuşak agar katlamalı bir tekniktir. Bu yöntem ilk olarak bakteriyofaj 12,13 numaralandırma yardımına 1936 yılında Gratia tarafından tarif edilmiştir.
Burada (üç farklı antimikrobiyal maddeler arasında bakteriyofaj ayırt, hedeflenen gen teknolojisi ve polietilen glikol (PEG) çöktürme ile kombinasyon halinde, yumuşak agar katlamalı yönteminin uygulanmasını tarif yüksek molekül ağırlıklı bir bactTek bir bakteri suşu tarafından üretilen eriocin ve düşük molekül ağırlıklı bir bakteriyosin). Bu yaklaşımın faydası o kesinlikle olmak 'düşük teknoloji' rağmen, hala yaygın olarak kullanılmaktadır neden olan nispeten basit ve ucuz olmasıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan yumuşak agar bindirme tekniği yaygın olarak bakteriyofajlar veya bakteriyosinlere ilgilenen araştırmacılar tarafından on yıllar boyunca uygulanmıştır. Bu yaklaşımın temel yararları, basit, ucuz ve yorumlamak nispeten kolay olmasıdır. PEG çökeltme ve seri dilüsyonu ile yumuşak agar kalıbı birleştirerek, antimikrobiyal ajanlar (örneğin bakteriofaj genel tailocin sırasıyla) replikatif olmayan genel düşük moleküler ağırlıklı maddeler genel yüksek ve replikatif maddeler ayrılabilir. Son olarak, farazi bakteriyosin veya profajından loci hedeflenen genetik manipülasyon (silme ve tamamlama) birleştirilmesi sıkıca belirli bir antagonistik bileşiğin kimliğini kurabilir. Biz son zamanlarda yeni bir bakteriyofaj türevi Pseudomonas syringae arasında yaygın bakteriyosin 9 suşları tanımlamak için bu yöntemi kullanmışlardır.
Pseudomonas sy için iyi bu protokol çalışmalarında gösterilen büyüme ortamı ve koşullarıringae ve büyük olasılıkla, bu koşullar altında kuvvetli bir şekilde büyümesi için diğer Gram-negatif bakteriler için yeterli olacaktır. Ancak, bu yöntemi kullanarak araştırmacılar kendi sistemi için zamanlama, kültür ortamı, indüksiyon yöntemi ve inkübasyon sıcaklığı optimize etmek isteyeceksiniz. kritik parametreler, logaritmik büyüme fazı sırasında üretim kültürü doğurma, hem de düzgün bir bakteriyel dağılımını sağlamak için yeterli Logaritmik faz kültürü ile yumuşak agar kalıbı tohum, ancak potansiyel temizleme bölgeleri belirsiz olacaktır aşırı derecede kültürü içerir. Orada SOS cevabının bir parçası olarak bağlı olmayan birçok bakteriyosinler, daha çok bu gibi peptid bazlı çekirdek algılama sistemleri, bu şekilde, bir araştırmacı, birkaç farklı indüksiyonu taranması için isteyebilir (15, özellikle Gram-pozitif bakteriyosinlerin) (aracılığıyla indüklenir uyarıcı ortam, ya da üreten bir suşundan uzun inkübasyon) sağlayan besin içeriğinin değiştirilmesi.
KullanırkenBu teknik, yumuşak agar katlamalı önce iyice tohumlama gerginlik ilavesinden 55-60 ° C'de eritilir ve muhafaza edilmelidir. Biz (görsel olarak ortaya çıktı gerçi) ve grenli görünüme sahip bir bindirme sonuçlandı yumuşak agar iyice erimiş değildi çeşitli deneyler vardı. grenli kaplama sonuçları hala ancak bu (gözlemlemek daha zor olacaktır zayıf inhibisyon) inhibe gücüne bağlıdır, genellikle yorumlanabilir olabilir. Bu teknik kullanılarak, erimiş agar sıcaklığı tohumlama gerginlik öldürme önlemek için, önceden tohumlama suşu ile aşılama soğumaya için yeterli bir zaman izin verilen zaman son bir, karıştırıcı bir değişken dikkate. Bu sorunu önlemek için, biz yumuşak agar dokunmak, sıcak, sıcak, ama olmadığından emin olun. Bu doğrultuda, biz de erimiş agar ACCLIMATE bir tohumlama kültürü için yetersiz zaman vermek durumunda, bindirme dökülmesinden önce, biz genellikle kötü bakteri g kurtarmak olduğunu gözlemledimBelirli engelleme zor veya imkansız yorumlanması yorumlamak için yapar rowth. Biz vorteks ve bindirme dökme arasındaki inkübasyon 10-15 ek süre bekleyin nedeni budur. Tamamen erimiş halde agar muhafaza arasındaki ticaret-off (sıcak değil daha iyidir) muhtemelen deneme yanılma yoluyla bir araştırmacı tarafından belirlenecek gerekecektir biridir tohumlama zorlanma değil öldürücü (sıcak iyidir).
PEG ile çöktürme kademesi kullanılırsa, steril sıvı ortamı kültür yüzey ile aynı şekilde işlenen bir negatif kontrol dahil etmek yararlı olacaktır. Bu aktiviteyi öldürme örnek süpernatant içinde kalan PEG veya kloroform sonucu olmadığını sağlayacaktır.
bakteriyofajlar ve bakteriyosinler hem son derece spesifik olma eğilimi de, soyların, belirli bir kombinasyonu ile belirgin bir öldürme aktivitesini karşılaşmaya bir durum değildir. Bu soy spesifik yeniden çeşitli kaynaklanabilirdirencin mekanizmaları, bir test suşu yoksun veya belirli bir bakteriyosin veya bakteriyofaj göre hedefleme için gerekli reseptörünün tanınmayan bir sürümü vardır ya varlık.
Alternatif bir yöntem, bakteriyosin tarama yöntemi Kawai ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir. Ama mahzurlar ve yaygın 16 kabul edilmemiştir. Özel olarak, bu teknik, külfetli olabilir zaman aralıklarında suyu örnekleri görülmesini gerektirmektedir ve türetilmiş-bakteriyofaj ve bakteriyosin türetilmiş öldürme faaliyetleri arasındaki ayrım izin vermez.
Bu tekniğin temel sınırlamaları iyi sağlam büyümek değil (ve böylece kolayca ayırt edilebilir takas bölgeleri olacak eksikliği) ya da sağlam laboratuvar koşullarında üretilmiş olmadığını liman prophages veya bakteriyosinleri organizmalar için uygun değildir olmasıdır. Bu tekniğin adaptasyon programı genişletmek istiyorum, hem çevresel örneklerde üretilen bakteriyosinleri tespit etmek içinve bu tekniğin doğal ortamlarında bakteriyosinlerin rolüne daha fazla fikir kolaylaştırır.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.
Materials
| Mitomycin C | Santa Cruz Biotechnology | sc-3514 | Carcinogenic. use appropriate PPE (i.e. gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution. |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 34854 | Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood. |
| Polyethylene Glycol (PEG) | Amresco | 0159 | |
| Bacteriological grade agar | Genesee Scientific | 20-274 |
Referências
- Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics. Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).
- Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. Toward a Predictive Understanding of Earth’s Microbiomes to Address 21st Century Challenges. MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).
- Michel-Briand, Y., Baysse, C. The pyocins of Pseudomonas aeruginosa. Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).
- Ghequire, M. G. K., De Mot, R. Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas. FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).
- Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. Colicin Biology. Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).
- Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare. Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).
- Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins. J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).
- Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas. MBio. 6 (4), (2015).
- Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins. Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).
- Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. Ecological Genomics of Pseudomonas syringae. Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).
- Gratia, A. Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage. Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).
- King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).
- Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria . Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).
- Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces. Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).
