JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Biologia

Isolamento e caracterização de microvesículas a partir de sangue periférico

Published: January 06, 2017
doi:
10.3791/55057
, , , ,
1Department of Hematology/Medical Oncology,University Medical Center Göttingen

Summary

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

Abstract

A liberação de vesículas extracelulares (SVE), incluindo as pequenas exossomos-endossomal (Exos, diâmetro <100 nm) e microvesículas derivados de membrana grande de plasma (MVs, diâmetro> 100 nm) é um processo celular fundamental que ocorre em todas as células vivas. Estas proteínas de transporte de vesículas, lípidos e ácidos nucleicos específicas para a sua célula de origem e em estudos in vitro em destaque a sua importância como mediadores de comunicação intercelular. VE foram isolados com sucesso a partir de vários fluidos corporais e, especialmente, os VE no sangue foram identificados como promissores biomarcadores para cancro ou doenças infecciosas. A fim de permitir o estudo de subpopulações MV no sangue, apresentamos um protocolo normalizado para o isolamento e caracterização de MVs a partir de amostras de sangue periférico. MVS são sedimentadas a partir de amostras de plasma anticoagulado com EDTA por centrifugação diferencial e, tipicamente, possuem um diâmetro de 100-600 nm. Devido ao seu tamanho maior, eles podemfacilmente ser estudada por citometria de fluxo, uma técnica que é utilizada rotineiramente em diagnósticos clínicos e está disponível na maior parte dos laboratórios. Vários exemplos de ensaios para as MVs isolado de controlo de qualidade vai ser dada e marcadores que podem ser utilizados para a discriminação de diferentes subpopulações de MT no sangue vai ser apresentado.

Introduction

Nos últimos anos, muitos estudos in vitro têm demonstrado que vesículas extracelulares (VE) desempenham um papel importante na comunicação intercelular. As células vivas constantemente eliminado vesículas que diferem em tamanho, conteúdo e biogênese. Os EVs melhor estudados são exosomes que se originam a partir do sistema endossomal onde eles são armazenados como vesículas intraluminais em corpos multivesiculares. Uma vez que esta última se fundem com a membrana plasmática, as vesículas contidos são libertados como exossomas (Exos, diâmetro de 30-100 nm 1). A segunda população de EV que ganha cada vez mais atenção nos últimos anos, são grandes microvesículas (MVs, diâmetro de 100 – 1.000 nm), que brotam diretamente da membrana plasmática 2.

Ambos os tipos de vesículas estão rodeados por uma bicamada lipídica e contêm ácidos nucleicos, por exemplo, ADN, ARNm ou miARN 3-5, e uma variedade de proteínas que se podem transferir para C vizinhaells. Embora, em geral, a composição de proteína das vesículas reflecte o estado de uma célula de origem, algumas proteínas parecem ser selectivamente orientadas e enriquecido em VE 1. Uma grande interesse de pesquisa é caracterizar EVs de células anormais e doentes, a fim de definir assinaturas EV específicas que possam permitir o uso de EVs como novos biomarcadores. Especialmente no cancro, em que muitas vezes o próprio tumor não é facilmente acessível, biópsias líquidos segmentação VE específicos de tumores no sangue pode permitir a monitoração das respostas terapia ou ajudar a caracterização do tumor primário, sem a necessidade de procedimentos invasivos 6.

Na verdade, EVs já foram isolados com sucesso a partir de vários fluidos corporais, incluindo urina 7, 8 CSF, o leite materno 9 ou sangue 10. Vários estudos identificaram alterações nas contagens de EV e composição em diferentes doenças humanas. Por exemplo, em pacientes com sepsia o número de MVs pró-coagulante éaumentou significativamente em comparação com indivíduos saudáveis 11. Também em pacientes com malária cerebral grave um aumento no total de MVs no sangue pode ser observada e contagens de MVs derivados de plaquetas correlacionar com profundidade coma e trombocitopenia 12. Outros estudos relatam números elevados de vesículas derivados do endotélio em doentes com lúpus eritematoso sistémico ou insuficiência cardíaca e, no caso deste último, esta está correlacionada com uma maior probabilidade de eventos cardiovasculares 13,14.

Especialmente no câncer, EVs no sangue estão atualmente discutido como novos biomarcadores com valor diagnóstico e prognóstico. Níveis de MVs que expressam proteínas associadas a tumores, tais como MUC-1, EGFR ou FAK parecem ser elevados no sangue de doentes com cancro da mama 15,16. Também para Exos, estudos recentes têm mostrado que Exos derivados do sangue que transportam antígenos específicos do tumor, como glipicano-1 para câncer de pâncreas ou Del-1 para o cancro da mama permitir cedo a doença deproteção com alta especificidade e sensibilidade 17,18. Adicionalmente, o tumor derivada de soro Exos pode conter ADN que pode ser utilizado para a detecção de mutações, tais como KRAS e p53 que sugere a sua utilização para a terapia de previsão 19. Avanços recentes têm mostrado que a análise de Exos no sangue de pacientes com glioblastoma utilizando um chip de microfluidos específica permite a monitorização da terapia 20. Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que a análise de subpopulações de doenças específicas de vesículas dá informações preciosas sobre diagnóstico, prognóstico, bem como as opções terapêuticas e sucesso.

No entanto, o isolamento e análise de Exos de sangue é morosa, requer equipamento especial de laboratório e, por conseguinte, ainda não é adequado para o diagnóstico clínico de rotina. Em contraste, o MVS pode ser isolado muito mais rapidamente e, devido ao seu grande tamanho, podem ser facilmente analisadas por citometria de fluxo, sem a necessidade de associá-los a esferas de látex, uma vez que é necessário para Exos 18, 21. Assim, aqui se apresenta um protocolo que pode ser utilizado para o isolamento de MVs padronizado a partir de amostras de sangue e a subsequente caracterização de sub-populações de MT por citometria de fluxo. Este protocolo irá permitir o estudo adicional e caracterização em profundidade de perfis de MT em grandes grupos de pacientes que serão necessários, a fim de utilizar MVS para diagnósticos clínicos diárias.

Protocol

Todos os experimentos, incluindo seres humanos foram aprovados pelo comitê de ética local (aprovação no. 3/2/14). Para a escolha dos pacientes deve-se notar que diversos fatores, tais como idade, sexo, regimes terapêuticos atuais e muitos mais podem influenciar a composição MV no sangue e, portanto, devem ser levados em consideração antes da coleta da amostra 22,23. 1. Preparação de amostras de plasma Desenhe 1 – 2 tubos de sangue por doador, através de uma agulha de borboleta de calibre 21 em um tubo vacutainer colheita de sangue contendo EDTA (1,6 mg / mL de sangue). Certifique-se de inverter o tubo (s) várias vezes para garantir anticoagulação sangue eficiente. NOTA: O volume recomendado de sangue por citometria de fluxo e posterior análise de Western Blot é de 5 – 15 mL. A fim de evitar a degradação e perda de MV, as amostras de sangue deverão ser manuseados <30 min após a retirada do sangue. Preparar as amostras de plasma por centrifugação das amostras durante 15 minutos a 1200 xg àtemperatura ambiente (RT). Aplicar um filtro de válvula, a fim de ajudar a separação de plasma (= camada superior) do restante células do sangue (= camada inferior). Transfira o plasma para um tubo de 15 mL. Centrifugar durante 15 minutos a 1500 xg, temperatura ambiente para sedimentar os detritos celulares e maiores remover plaquetas remanescentes. Transferir o sobrenadante para um tubo de 15 ml e proceder diretamente com amostras de isolamento ou de loja MV para até 6 meses a -20 ° C. NOTA: O protocolo apresentado também pode ser usado para isolar e (MVs Exos) a partir de sobrenadantes de cultura de células. A fim de fazer isso, cultivar as células a 60 – 80% de confluência, durante 24 – 48 h em meio de cultura suplementado com FCS a depleção de vesícula, e em seguida, recolher o sobrenadante. Centrifugar durante 5 minutos a 750 xg, a 4 ° C para destruir as células flutuantes residuais, encher o sobrenadante para um novo tubo de 15 ml e centrifugar de novo durante 5 min a 1500 xg, 4 ° C para sedimentar os detritos celulares maior. Este sobrenadante pode então ser usado para o isolamento de MVstal como descrito no Passo 2,1-2,16. 2. Isolamento de MVs Transfira a amostra de plasma num tubo de centrifugação adequado. Se necessário, encher tubo com PBS, a fim de diluir a amostra e evitar o colapso de tubos de paredes finas durante o processo de centrifugação. Centrifugar durante 35 minutos a 14000 xg, 4 ° C. Decantar o sobrenadante, mantenha tubos virou de cabeça para baixo e coloque sobre uma toalha de papel. Espera 3-5 minutos até que todo o restante sobrenadante foi embebido na toalha e assim removido a partir da amostra. Ressuspender o sedimento em MV 1000 ul de PBS, transferido para um tubo de 1,5 mL e centrifuga-se durante 35 min a 14000 xg, a 4 ° C numa centrífuga de mesa. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento MV em 50-500 ul de PBS, dependendo do tamanho do pelete. Alternativamente, lisam MVs directamente, por exemplo, em tampão de RIPA (NaCl 150 mM / 0,1% SDS / 0,5% de Na-desoxicolato / 1% de Triton X-100 / Tris 50 mM, pH 7,2)para análise de Western Blot subsequente. MVs armazenar a -20 ° C. Eles vão permanecer estável durante vários meses, mas evitar congelamento e descongelamento ciclos repetidos. Opcional: Determinar a concentração de proteína MV com um ensaio de proteína (por exemplo, Bradford ou método de Lowry), a fim de avaliar o rendimento mV ou dosear MVS para experiências subsequentes. Se Exos adicionais são para ser isolado a partir das amostras de plasma, decanta-se o sobrenadante a partir do passo 2.3 para um tubo de ultracentrifugação e centrifuga-se durante 2 h a 110.000 xg, 4 ° C. Decantar o sobrenadante tal como descrito no passo 2.3, ressuspender Exo sedimento em 1000 uL de PBS e transferir para pequenas (1,5 ml) tubos de ultracentrifugação. Ultracentrífuga durante 2 h a 110.000 xg, 4 ° C, o sobrenadante aspirado e ressuspender o pellet em Exo 50-75 ul de PBS ou tampão RIPA. 3. Caracterização de MVs por citometria de fluxo Transferir 15 uL de PBS + 1% de soro fetal de vitelo empobrecido de vesículas (FCS) num tubo de citometria de fluxo. NOTA: vesículas com FCS empobrecido é preparado por centrifugação inactivado pelo calor (30 min a 56 ° C) de FCS durante 18 h a 110000 xg e filtração do sobrenadante através de um filtro de 0,2 um, tal como descrito anteriormente 24. Adicionam-se 5 ug (em caso de baixos rendimentos 3 ig), são igualmente aplicáveis ​​de MVs em PBS. Incubar as amostras durante 30 min à temperatura ambiente, a fim de bloquear os sítios de ligação não específicos na superfície de MV e, assim, reduzir a coloração de fundo. Adicionar um anticorpo marcado por fluorescência contra o interesse da proteína-de-. Titula-se a quantidade de anticorpo utilizada para a mancha, antes da utilização, a fim de determinar a concentração óptima e garantir uma ração baixo sinal-para-ruído. Certifique-se também incluir um tubo com MVs não coradas como controlo negativo e um tubo de MVs coradas com o anticorpo de controlo de isotipo correspondente à mesma concentração (por exemplo, se 1 ug de anticorpo é utilizado, também utilizar um ug do um controlo de isotipotibody) para quantificar a coloração de fundo. NOTA: Também é possível realizar fluxo multicolor citometria adicionando vários anticorpos acoplados a diferentes fluorocromos. Incubar durante 20 min à temperatura ambiente no escuro. Adicionar 250 mL PBS e proceder com a medição da amostra usando um citômetro de fluxo. No caso de amostras que não pode ser medida de imediato, adicionar 150 ul de PBS e 50 uL de 4% de paraformaldeído (PFA) para fixar as amostras e armazenar a 4 ° C. CUIDADO: PFA é tóxico. Use luvas e equipamento de protecção individual adequado. Reduzir o limiar do citômetro de fluxo para o valor mais baixo possível e procurar a população MV usando uma dispersão para a frente (FSC) versus dispersão lateral (SSC) enredo em escala logarítmica. Porta na população MV e avaliar o sinal de fluorescência em um histograma correspondente. 4. Caracterização de MVs por Western Blotting Ressuspender o sedimento em MV directamenteum tampão de lise apropriado (por exemplo, tampão de RIPA). No caso de o sedimento MV já foi ressuspenso em PBS, diluir, pelo menos, 1: 1 num tampão de lise apropriado (por exemplo, tampão de RIPA). Determinar a concentração de proteína da amostra MV, por exemplo, por ensaio de Lowry. Preparar 10-20 ug de MVs em 22,5 ul de tampão RIPA. Em seguida, adicionar 7,5 mL de 4x tampão de carga Laemmli e calor durante 5 minutos a 95 ° C. Carregar as amostras sobre um gel de poliacrilamida e realizar electroforese e imunotransf erência de acordo com protocolos padrão. Depois de transferir as proteínas para a membrana, realizar uma coloração de Ponceau como um controlo de carregamento de acordo com protocolos padrão. membrana Destain em TBST durante 5 min à TA. Bloco de membrana durante 30 min até 1 h, à RT, em 5% de BSA em TBST. Incubar membrana com o anticorpo primário a 4 ° C durante a noite ou durante 2 h à TA. Lava-se a membrana com TBST 3 x 5 min. Incubar membrana com o anticorpo secundário acoplado a HRP a uma diluição de 1: 10000 em BSA a 5%. Nota: Em caso de sinais de alta fundo, use leite em pó em vez de BSA. Lava-se a membrana com TBST 3x 5 minutos. Desenvolver membrana com um reagente de detecção ECL e detecção de sinais de quimioluminescência em filmes ou um sistema de imagem de quimioluminescência. NOTA: No fim de discriminar MVs de Exos, proteínas como Tubulin, actinina-4 ou mitofilin pode ser usado que deve ser, sobretudo, presente no MVs 16,25. Prestar atenção que os anticorpos mais tetraspaninas (por exemplo, CD9, CD81), utilizados como marcadores para Exos, não funcionam sob condições redutoras e deve, portanto, ser preparados em tampão não redutor de carga seguido por aquecimento durante 10 min a 70 ° C.

Representative Results

A fim de quantificar o rendimento de MVs que podem ser isolados seguindo o protocolo descrito, calculou-se a quantidade de MVs isoladas a partir de amostras de sangue de 10 dadores. O rendimento MV, que foi avaliada num ensaio de proteínas de Lowry, variou de 10 até 30 ^ g, com uma média de 19,2 ug MVs por mL de sangue (Tabela 1). A concentração de partículas determinado por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) variou de 1,66 x 10 9-2,36 x 10 10 com uma média de 5,9 x 10 9 partículas por ml amostra de plasma (Tabela 2). Além disso caracterização das MVs por microscopia eletrônica de transmissão revelou uma população de vesículas com um diâmetro> 100 nm que foram cercados por uma bicamada lipídica e não contêm quaisquer organelos celulares (Figura 1A). NTA confirmou que o tamanho das MVs isolados variou de 100 a 600 nm (Figura 1B) e o tamanho médio foi de 201 MVnm (Figura 1C). A coloração para marcadores típicos de MT e Exo por Western Blotting demonstrado que as MVs isoladas foram positivas para a tubulina e mostrou apenas uma ligeira expressão de CD81 e CD9, enquanto Exos foram negativos para a tubulina e enriquecido em CD9 e CD81 (Figura 2). Análise dos MVs isoladas por citometria de fluxo (Figura 3A) revelaram uma população de vesículas definidas que poderia ser fechado usando os mesmos parâmetros normalmente utilizados para MVS isolados a partir de sobrenadantes de cultura de células e que foi claramente diferente da do sinal de fundo obtido pela medida de PBS + 1% de vesículas com depleção de FCS sem a adição de MVs (Figura 3B). De modo a analisar as diferentes populações MV presentes no sangue, o MVS foram coradas com marcadores estabelecidos para as diferentes populações de células do sangue, por exemplo, CD62P para MVS derivados de plaquetas, CD45 para MVS derivados de leucócitos, para CD235aMVs e CD62E sangue vermelho de células-derivadas para MVS derivadas de células endoteliais (Figura 4). Esta caracterização mostrou que a percentagem de subpopulações MV diferiu entre as amostras de sangue do dador investigados, enquanto a maioria de MVs parecia ser derramado por plaquetas em todas as amostras. Figura 1: Distribuição do Tamanho de MVs isoladas do sangue periférico. A, isolados MVs foram visualizadas por microscopia eletrônica de transmissão. B, análise de rastreamento de nanopartículas representativas (NTA) de MVs que ilustram a distribuição de tamanhos das vesículas. C, O tamanho médio MV a partir de 10 preparações independentes foi medida por NTA (média). Por favor clique aqui para ver alversão Arger desta figura. Figura 2: Caracterização de MVs isolado por Western Blotting. a expressão da proteína diferencial nas MVs isoladas e Exos de dois doadores foi visualizado por Western Blot. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Análise de MVs por citometria de fluxo. A, MVs são primeiro visualizadas em frente (FSC) versus espalhamento lateral parcelas (SSC) para a porta na respectiva população MV. Subsequentemente, estes são caracterizados MVs para o antigénio de interesse pela utilizando anticorpos marcados com fluorescência dirigidos contra o antigénio. B, o FSC SSC típica contra parcelas para MVS isoladas a partir do plasma de dois dadores. Como comparação, um lote típico para MVS derivadas de células de tumor a partir de células de cancro do pulmão A549, isolado a partir do sobrenadante de cultura de células, bem como um controlo negativo utilizando apenas PBS + 1% de vesículas com depleção de FCS sem MVS são mostradas à direita. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 4: Caracterização de MVs isolado por citometria de fluxo. MVs de três dadores foram caracterizadas para a expressão de marcadores de células de sangue vermelhas estabelecidos (), por citometria de fluxo. Os respectivos controlos isotípicos são mostradas em cinza.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Amostra MVs / mL de sangue [g] # 1 29,4 # 2 10.3 # 3 15.2 # 4 31,1 # 5 18.8 # 6 22,7 # 7 19.1 # 8 18,7 # 9 15,0 # 10 11,9 Tabela 1: rendimento de proteína de MV amostras de sangue periférico. </strong> É mostrada a quantidade de MVs por sangue periférico mL que foi elaborada a partir de 10 doadores. MV rendimentos foram quantificados por ensaio de Lowry. Amostra MVs / mL de plasma [contagem de partículas] # 1 6.42E + 09 # 2 2.36E + 10 # 3 1.88E + 09 # 4 6.51E + 09 # 5 3.48E + 09 # 6 4.57E + 09 # 7 2.09E + 09 # 8 1.66E + 09 # 9 2.54E + 09 # 10 6.20E + 09 Tabela 2: MV Rendimento de partículas a partir de amostras de sangue periférico. </stRong> MV foram isolados a partir de amostras de plasma de 10 doadores e contagens de partículas foram determinadas por análise de rastreamento de nanopartículas. É mostrado o valor médio de três medidas independentes.

Discussion

Estudos recentes sobre EVs no sangue demonstraram que a composição e as contagens EV mudar durante a causa de várias doenças. Portanto, a análise e posterior caracterização destas EVs são de grande interesse para avaliar melhor a sua utilização potencial como biomarcadores da doença para diagnóstico e prognóstico ou para avaliar as respostas de terapia. O protocolo apresentamos aqui permite o isolamento de vesículas com um diâmetro de até 600 nm, que não contêm quaisquer organelos celulares. Estas observações estão em consonância com a actual definição de MVs e excluir a presença de corpos apoptóticos 2. Usando a técnica Western Blot, fomos capazes de demonstrar que as MVs isolados mostram uma elevada expressão da tubulina, enquanto que os tetraspanins CD9 e CD81 que são frequentemente usados ​​como marcadores Exo foram apenas ligeiramente expressa. Isto confirma que MVs diferem de Exos e se encaixa a recente caracterização em profundidade e comparação de ambas as populações EV por proteômica 25.

conteúdo "> Durante a aquisição de amostras de sangue, é crítico para manter o tempo entre a punção venosa e preparação plasma tão curto quanto possível, a fim de evitar a degradação do MV. Além disso, o armazenamento prolongado de amostras de sangue pode levar à activação de células de sangue causando reforçada MV derramamento e, finalmente, a apoptose, que resulta na libertação de corpos apoptóticos. Outra consideração importante para o isolamento MV é para evitar contaminações de preparações MV com proteínas do plasma ou Exos menores. Portanto, é essencial para remover tanto do sobrenadante quanto possível depois de girar para baixo MVS a 14000 x g. uma vez que o sedimento é normalmente visível e firmemente fixado à parede do tubo, o sobrenadante pode ser facilmente removido com uma ponta de pipeta. Em contraste com Exos que tendem a formar agregados durante a preparação por ultracentrifugação alta velocidade e são muitas vezes difíceis para voltar a suspender, este problema não ocorre com MVs.

Nosso estudo mostra que é possible para caracterizar subpopulações MV presentes no sangue por citometria de fluxo. Embora o limite de detecção da maioria dos citómetros de fluxo é de cerca de 200-300 nm, o MVS foram reprodutivelmente medido no dador, bem como amostras de cultura de células com os mesmos parâmetros de análise e portões que permitiram claramente a sua distinção de sinais de fundo. É importante verificar antes das medições que o PBS usado para as análises não contém quaisquer partículas contaminantes que poderiam causar um fundo elevado durante a citometria de fluxo (Figura 3). Embora alguns MVs menores não pode ser capturado numa abordagem por citometria de fluxo, verificou-MVs de todas as principais populações de células do sangue (por exemplo, plaquetas, glóbulos vermelhos, leucócitos, células endoteliais). Em nossas análises usamos marcadores padrão para as diferentes células do sangue que tenham sido previamente encontrados no MVS 26 – 29. Deve notar-se que, a fim de obter os melhores resultados possíveis por citometria de fluxo, tele quantidade e a concentração de todos os anticorpos devem ser tituladas numa amostra MV expressando o antigénio de interesse. Se subpopulações MV específicos no sangue devem ser identificados com maior especificidade, é possível realizar a coloração dupla contra dois antigénios diferentes presentes nos respectivos MVs e considerar apenas todas as MVs duplamente positivas para posterior análise 23. Atualmente, existem esforços para definir uma escala padrão de subpopulações de MT no sangue de indivíduos saudáveis 23,30. Estes estudos já demonstraram que MVs derivados de plaquetas constituem a maior população de MVs no sangue que está em correspondência com as nossas observações.

Uma vantagem da citometria de fluxo para caracterizar amostras de MT é que este método já está bem estabelecida para fins de diagnóstico, na maioria dos centros clínicos que permitam o possível uso de MVs como biomarcadores no diagnóstico clínico diárias. Estudos anteriores sobre EVs no sangue que têm na sua maioria focoed em Exos menores, dependem tanto procedimentos de classificação específicos para analisar selectivamente a população alvo desejado Exo 31,32 ou requerem um (2 dias) Processo de isolamento demorado com acoplamento de Exos a pérolas de látex antes da análise 18. As nossas próprias observações não publicadas sugerem que a análise de citometria de fluxo de MVs de preparações de sangue inteiro mesmo permite a detecção de MVs como MVs derivadas de tumor sem qualquer desses processos de selecção.

Tomados em conjunto, o protocolo aqui apresentado permite o isolamento rápido de MVs a partir de amostras de sangue periférico com equipamentos de laboratório padrão e sua qualificação ulterior por citometria de fluxo e Western Blotting. Todo o processo pode ser realizado em cerca de 2 h, o que vai facilitar futuros estudos sobre perfis de MT em sangue de pacientes que são necessárias para avaliar o potencial de MVs como biomarcadores da doença.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.

The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

Materials

butterfly needle (21 gauge) Hospira Deutschland GmbH 490P29201
Bovine serum albumin Fraction V Roth 8076.3 For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20
CD235a-PE Beckman Coulter A07792 use 5µl for staining
CD45-FITC Beckman Coulter 7782 use 5µl for staining
CD62E-PE Biolegend 336008 use 0.8µg for staining
CD62P-PE Biolegend 304905 use 0.1µg for staining
CD81 antibody Biolegend 349501 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
CD9 antibody Immunotools 21270091 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 Fujitsu Life Sciences
DC protein assay kit II Bio-Rad 5000112
ECL detection reagent GE Healthcare RPN2232
EDTA vacutainers for blood collection Sarstedt 01.1605.001
FACSCanto II BD Biosciences
fetal calf serum (FCS) Invitrogen 10091148 heat-inactivated (30 min, 56°C)
filter 0.22µm Sarstedt 83.1826.001
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody santa cruz sc-2005 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody santa cruz sc-2004 use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 Roth K929.1
microfuge SIGMA 1-15K Sigma Laborzentrifugen
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) BioRad 170-6404
multifuge 3 L-R Heraeus
NanoSight LM10 NanoSight Ltd.
PBS, w/o Ca and Mg Pan biotech P04-36500
perfusor syringe 50 mL Braun 8728844F
Ponceau-S staining solution PanReac AppliChem A2935,0500
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) Beckman Coulter
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) Beckman Coulter
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) BD Biosciences 352054
tubes for ultracentrifugation (15 mL) Beckman Coulter 344061
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) Beckman Coulter 343778
Tubulin antibody Millipore 05-829 1:5000 in 5%BSA in TBST
ultracentrifuge Optima L-80 XP Beckman Coulter
ultracentrifuge TL-100 Beckman Coulter
valve filter Seraplas V15 Sarstedt 53,428
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, (2015).
  3. Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA. J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).
  4. Balaj, L., et al. Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences. Nat Commun. 2, 180 (2011).
  5. Lee, T. H., et al. Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells. Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).
  6. Chi, K. R. The tumour trail left in blood. Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).
  7. Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  8. Harrington, M. G., et al. The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid. Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).
  9. Admyre, C., et al. Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk. J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
  10. Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma. Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).
  11. Nieuwland, R., et al. Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis. Blood. 95 (3), 930-935 (2000).
  12. Mfonkeu, J. B. P., et al. Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria. PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).
  13. Parker, B., et al. Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).
  14. Nozaki, T., et al. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).
  15. Galindo-Hernandez, O., et al. Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients. Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).
  16. Menck, K., et al. Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN. J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).
  17. Moon, P. -. G., et al. Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection. Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).
  18. Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
  19. Kahlert, C., et al. Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer. J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).
  20. Shao, H., et al. Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy. Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).
  21. Lässer, C., Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes. J Vis Exp. (59), (2012).
  22. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  23. Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans. Biol Sex Differ. 6, (2015).
  24. Shelke, G. V., Lässer, C., Gho, Y. S., Lötvall, J. Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
  25. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).
  26. Dignat-George, F., Boulanger, C. M. The Many Faces of Endothelial Microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).
  27. Esser, M. T., et al. Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation. J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).
  28. Canellini, G., et al. Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry. Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).
  29. Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., Lösche, W. Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P. Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).
  30. Berckmans, R. J., et al. Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation. Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).
  31. Rupp, A. -. K., et al. Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage. Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).
  32. Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).

Tags

MicrovesiclesPeripheral BloodPlasmaCentrifugationFlow CytometryCharacterizationProtein ConcentrationProinvasiveMetastasisTumor PatientsEDTAPBSFCSAntibody

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Menck, K., Bleckmann, A., Schulz, M., Ries, L., Binder, C. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. J. Vis. Exp. (119), e55057, doi:10.3791/55057 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image