在脑组织成像金属激光剥蚀 - 电感耦合等离子体 - 质谱法（LA-ICP-MS）

本文所述程序已批准霍华德弗洛里动物伦理委员会，并坚持以动物保健的国家健康与医学研究委员会的标准。 1.分析试样的制备注：该步骤取决于样品基质进行分析而变化。 样品制备和切片注：使用固定的4％多聚甲醛（PFA）和在30％的蔗糖冷冻保护在0.1M PBS中，将导致不同的来自组织的金属浸出的量。详情请见野兔等[19]。确保所有样品都发生了相同的固定和冷冻保护措施。 Transcardially灌注用冰冷的0.1M PBS，pH值7.4安乐死的动物（见Dodt 等 20详细方法部分），并取出大脑。 放置脑在4％PFA O / N来修复组织。 <利> Cryoprotect大脑通过将其放置在30％的蔗糖在0.1M PBS中24小时，然后再改变到新的30％的蔗糖另外24小时。 19 冻结在低温恒温器的脑在-20℃放置至少1小时。 安装在使用合适的安装介质卡盘的大脑。 部分上使用不含金属的一次性刀片低温恒温器脑（ 例如，聚四氟乙烯[PTFE]涂层，刀具）和安装在标准显微镜载玻片。此部分的最佳厚度应为大约30微米。 如果使用石蜡包埋的样品，部分以所需的厚度，浮色带上温水浴和安装在标准显微镜载玻片。 注：长期固定和生物样本的石蜡包埋的确切影响还不清楚。正如在1.1中所述，确保所有的样品都发生了相同的样品制备程序，如果对比分析的目的。 脱蜡PA拉芬包埋标本在二甲苯中3的变化，1变更各浸渍滑动：100％的乙醇，95％乙醇，70％乙醇，并在ISO 3696或等效纯化水（以下称最小3的变化，被称为“水';看到野兔等 21进行了详细的方法）。 允许样品风干用于在无尘的环境中约1小时，如与在机架垂直放置的试样的滑动框和左半开盖子。 2.基质匹配标准的研制注：以下是先前公布的9汇总协议。请咨询原纸上，以准备基质匹配标准组织的详细步骤。 获得商业头脑羊肉（或类似），并在水冲洗，清除所有血液和结缔组织。 使用手术刀，解剖仔细大约50克皮质Tissu酒店的e和部分均匀使用手持式组织匀浆与低功率的聚碳酸酯一次性探针。划分成5个克一份，以根据不同的校准范围和期望的校准点数目。 制备金属的溶液通过溶解每种分析物的可溶性盐（ 例如， 硫酸亚铁·H 2 O）在1％硝酸，以产生0.1，1和100mg金属毫升-1股穗每个标准。 储液的一个预先计算的体积添加到5克等分组织（10毫克如 5微升毫升-1 10微克克-1湿纸巾的一个近似的最终浓度），以实现一个范围在加标金属水平的每个标准。 根据每个标准的所需最终浓度，可以使用各金属原液的组合，以确保解决方案的最小量被添加到标准。水最后秒杀添加到每个标准，以确保球菌补充液体量价出现在每个标准。 均质低功耗的飙升标准约30秒。如果不立即使用，在-20℃保持冷冻在用Parafilm密封封端的聚丙烯管中。 确定准确的浓度，它可以使用以下步骤每个标准的同质性： 微波消解放置6精确称量（约50毫克）的标准的等分试样在洗涤聚四氟乙烯消化容器中，并加入4毫升浓（65％）的硝酸和1毫升30％的过氧化氢。密封，并在500瓦消化30分钟。 冷却该消化容器中，打开在通风橱并定量之后将消化溶液转移至用10mL水的等分试样的酸洗50毫升管中。使约50毫升，并准确称量最终溶液的质量。 每个标准2.5.1.2 – 重复步骤2.5.1.1。 如果微波消解设备不可使用以下步骤： 将6精确地测量（介于25 – 200毫克）的标准等分入酸洗/无金属聚丙烯管和冷冻干燥O / N。 添加浓硝酸和热，未封端的40微升，加热块上至70℃5分钟，然后添加30％过氧化氢10μL的。热再5分钟，然后准确地使用的1％硝酸950微升1毫升总体积。 注：建议使用选择的方法，以确保消化过程是准确的消化认证的参考材料。 确定在使用的标准协议通过溶液雾化ICP-MS的每个消化溶液中的金属浓度。通过确定每个等分试样之间的相对标准偏差（％RSD）评估每个标准的均匀性。确保％相对标准偏差都落在15％以内。使用EA的质量测量CH等分，计算出每个匀浆组织标准的精密金属浓度。 返回到均质化的组织标准，包5×5mm的一次性塑料组织学模具和冻结的异戊烷在液氮中冷却。 在相同的厚度除去样品中从模具和部分上低温恒温器的冷冻标准组织块。 注：建议在不同厚度为未来的实验准备一些部分。风干标准可以无限期储存在气密无尘容器。 3. LA-ICP-MS的研制分析地方标准和样品中的消融室中，以确保它们是装配到洛杉矶单元CCD照相机的景深内。如果仪器的调整是必要的，包括合适的参考材料（ 例如，NIST 612微量元素玻璃）。用手拧紧在房门上的两个螺丝密封日Ë消融室。 在ICP-MS软件，在“维护”或类似的面板中选择打开的氩气阀和载气流量设定为1.2升分钟-1在适当的对话框。 注意：在这个协议中使用氩作为载气。几个例子使用任一氦或作为载气氦气和氩气的混合物。半滑舌鳎见海因里希22使用氦气和氩气混合物作为气溶胶的载气的技术细节。 在洛杉矶软件，点击“清除”按钮来刷新氩气电池最少30分钟。 注：吹扫时间可以通过单击“清除时间”或类似的按钮来改变。当使用消融系统具有两卷消融细胞，周期性地移动所述平台的每个角落和斜对地横过该细胞，以确保尽可能多的残留的空气被从细胞尽可能除去。这可以通过选择“家庭阶段”或当量实现alent功能。 打开的ICP-MS通过点击“等离子体上，并允许温热两小时，在此期间，步骤3.5 – 4.4可被进行。仪器设置制造商之间变化，尽管适当的LA-ICP-MS的操作条件，例如可以在兔等中找到。 10。 组织标准代表消融选择行工具和大约长3毫米绘制整个组织表面烧蚀一行。 设置的参数通过右击消融的线中的实验列表并改变下列如下：光束直径（由用户适当选择;一个30微米的正方形光束这里使用），扫描速度（光束直径的4倍每秒120微米-1）和能量密度（0.3 -0.5Ĵ厘米-2软组织;优化如有必要，更难矩阵）。在30微米的组织厚度的激光束不穿过充分THIC该组织kness，消除从显微镜支持任何潜在的污染物。正火碳23可被用来校正在组织的消融的量的变化。设置这些参数作为默认选择“默认”单选按钮，每个后续行。 通过选择初始行，右击并选择“重复扫描'复制此行六次。确保线在任一偏移的X -或由光束直径y轴。这给出了一个总的每标准七条线路，根据光束直径隔开。 重复步骤3.5.1 – 3.5.3每个标准，确保相同长度的线。 要绘制消融面积超过示例，可以按照以下两种方法之一： 注：确保相同的扫描参数（光束直径，扫描速度，能量密度）用于采样线。 如果LA系统配备有一个宽视场中，选择线工具和从样品足够长以覆盖使用在3.5中概述的相同的激光参数在其最宽点处的样品的左上角画出一条线。重复该扫描与根据光束直径间隔的线在3.5.3概述作为根据需要许多次，以确保样品完全覆盖。 如果宽视场不可用，确定并记录x和y坐标（通常示出的主画面为“台位置”或类似的）相应于覆盖整个样品的矩形的角落。使用这些坐标来定位消融的平行线覆盖整个样本区域中3.7.1所述。 绘制的在后的最新标准间歇扫描线〜通过重复在3.5中描述的方法扫描样品的20小时。取决于此，可能需要多次样品的扫描持续时间。结束实验用阿迪的标准TIONAL扫描。 注意：当确定所述x和y坐标，而该细胞被清除，选择基准位置和轴的相关校准将改变先前获得用于x细节和y坐标，而差（ 即线的长度）将不受影响。 4.设置了ICP-MS的数据采集方法消融的标准线，由激光扫描速度划分线的长度，以确定为单行的总分析时间。重复此为样本行。 在ICP-MS软件，创建新方法（此处显示为“批”），确保“时间分辨分析”或选择了等同。选择待检测的m / z值，然后调整积分时间为每个M / Z，以便在一个周期的总积分时间等于0.25秒。点击“保存蝙蝠CH作为“和相应的名称（ 例如，STD1）。 注：由于样本将在光束直径的4倍遍历的激光束，这确保了每个质量数据点被记录相当于光束直径12。例如，使用100微米的光斑尺寸，为400μms的扫描速度-1为0.25秒的积分时间将产生与真正的像素大小的图像。积分时间可以调整，以提高灵敏度;增加积分时间，以0.33小号扫描速度时，应放慢至光束直径的三倍。 对于标准，进入分析时间在相应的框中的每一行扫描，外加15秒要占激光预热和清洗时间。输入样品运行列表（ 即在其中扫描的运行顺序）具有相同数目的收购（典型地按顺序编号， 即 001，002 等 ）的标准线的总数 。 对于示例，通过保存一个替代的文件名的当前方法或分批重复用于该标准的方法中，并调整总采集时间（包括附加的15秒）和收购总数以匹配将烧蚀样品的行数。 注：由于大部分的LA-ICP-MS系统使用一个单向触发（LA触发ICP-MS），它是必不可少的ICP-MS软件的消融开始的下一行之前等待来自LA触发。在ICP-MS采集窗口将显示“等待开始”。 5.运行实验通过加入第一种方法或分批到队列开始的ICP-MS队列，并确保该软件被从LA系统等待触发。 在洛杉矶软件，通过点击'发射'使激光电源，单击“运行”，并在相应的框中激光预热时间为10秒和冲洗时间设置为20秒。 注意：此溢出会保证了ICP-MS准备开始获取新的数据时，激光烧蚀开始后面的每个行。 通过点击'开始'启动激光序列。如果使用双卷细胞，确保样品杯是在适当的位置。 6.定量计算标准注：对于转换ICP-MS数据转换成图像多种变化。这些措施包括使用写在开源语言的17，24，25，商业宏26和数据分析软件的国产软件工具。 7这里，使用最近开发的软件插件（在Paul 等27描述的）的基础上，一个专门的LA-ICP-MS数据分析套件28。 在传输所有包含运行数据（001.d，002.d 等 ）批处理文件夹复制到单独的计算机安装了分析软件。提取该批次的每一行* .csv的数据文件到一个单独的文件夹中。 注：使用脚本来自动传送* .csv的文件到一个新的文件夹，强烈推荐。见所附Python代码的更多细节。此脚本已被写入，以适应任一的Agilent 7700或8800系列ICP-MS，但是可以进行编辑，以适合从其他厂商的输出文件。 打开软件平台，并按照标签顺序导入和分析标准如下所述产生量化图像。 要导入从第一批的标准数据，选择“安捷伦的.csv”为“文件类型”，“整个文件夹”的“导入式”，并检查“日期格式”是用电脑格式相同。点击“导入”，选择包含.csv的文件的第一套标准的文件夹，并移动到“基线”选项卡。 底线减法使用从工具栏的主应用程序下拉菜单的“自动选择”选项卡（命令2），选择“从导入信息”，然后点击“继续”。 点击“全选”，然后选择“Baseline_1”进行整合。 选择第一个10秒每条扫描线（对应于激光预热时间）中，输入第二个值“0”和作物的数据“（行的时间-第10号）”，然后单击“添加Integrations公司（ 如，对于一个35秒的扫描线，输入值'0'和'25'）。 要选择样本数据，使用“自动选择”选项卡，在6.4描述，但选择“OUTPUT_1”作为整合。从一开始，每个标准行结束作物数据排除背景信号（用于一个35秒的扫描线例如 ，输入值“13”和“4”）。 以排除液滴造成possi信号在标准BLE孔，在“样品”选项卡，单击图形区域的左上角“渠道”，选择具有高信噪比（如 C13或P31）的通道。请记在信号的急剧下降，并选择一个CPS值足够低，是样品中的正常变异的下方，但足够高，以挑选出的信号的急剧下降。 点击“DRS”选项卡，然后选择“当前数据缩减计划'Baseline_Subtract”。选择6.6“指数频道”的频道和'屏蔽低信号时，门限用'的CPS值。插入一个值<0.5秒'秒钟，然后修剪/低后信号'以考虑从激光到ICP-MS信号传输的延迟。 要确认低信号区足够的遮蔽，单击后退到“样品”选项卡并选择处理（ 例如 ，Fe56_CPS）通道轨迹。重复和完善CPS和＆＃39，秒修剪前/低信号的价值观后，在6.7，如果必要的。 点击“结果”选项卡，并从主应用程序的下拉菜单中选择“导出数据”。输入一个文件名来生成结果的电子表格数据文件（ 例如，STD1计算，STD2 …）。 开在合适的电子表格程序中的数据文件，并计算CPS值来进行定量每个单独的信道。使用从溶液雾化的ICP-MS的预定金属浓度从CPS值计算的转换系数到ppm（微克g -1）以上的每个量化的元件。 重复步骤6.3 – 6.10对所有套在运行标准。 7.构建定量图片写'Biolite（）'在命令提示符中打开该软件。 通过点击“载入图片”，然后选择文件夹包含.csv的文件导入FO样本数据r为样本图像。 背景校正点击“基准”选项卡应用背景校正的样品。在磷（P31）影像提示在屏幕上，使用矩形工具绘制背景的选择区域。选择尽可能多的区域尽可能将创建信号/等离子体漂移的图象全图，以确保从这些干扰因素足够的补偿。 为了使背景信号更加明显，选择图形编辑工具（左上方显示的图像），并右键单击图像。选择“修改图像外观”和“在Z =首先颜色”变更为较大的负值（ 如 -100,000）。点击“完成”继续。 点击“标准”选项卡，弹出一个表CPS / ppm的校正因子。在步骤6.10的每个元件的输入与标准计算值。这一步骤将有助于以校正在ICP-MS的灵敏度漂移。点击“开始！ 从“数据”选项卡，其中包含每个元素和每一步的图片打开“数据浏览器”。 要完成出口图像，请在“StdCorrImages”文件夹中所需的图像，用鼠标右键单击图像名称（* _ppm），然后单击“NewImage”。右键点击图片打开“修改图像外观”来选择所需的颜色表和色阶。通过右键点击图片，选择“添加注释”色标添加到图像。从左上角的下拉菜单中选择“ColorScale”，并使用选项卡来修改所需的色阶。 要导出图像，确保有问题的图像被选择并导航到“文件”选项卡，然后单击“保存图形…”。选择所需的格式并保存图像。另外，所选择的图像可以使用复制和粘贴工具进行传输。 重复步骤对所有感兴趣的图像7.6和7.7。 Quantif英离散区域要激活ROI工具，导航到“分析”选项卡中，“包”，选择“图像处理”。 选择所需的图像，然后导航到“图片”选项卡，点击“投资回报率……”。点击“开始抽奖的投资回报率”，并使用绘图工具来选择样本中的感兴趣区域。要完成图形中，单击“完成的投资回报率”。 为了获得所选择的投资回报率的统计数据，导航到“图像”选项卡并单击“统计…”。 复制并粘贴结果到一个单独的电子表格。重复投资回报率选择（7.9.2）的所有地区和感兴趣的内容。