Summary

Düşük Yoğunluk İlköğretim Hipokampal Nöron Kültürü

Published: April 18, 2017
doi:

Summary

Bu makalede, bir glial tek tabakalı üzerinde ters cam lamelleri büyüyen düşük yoğunluklu birincil hipokampal nöronlar kültürleme için protokol açıklar. nöron ve glial tabakalar parafin mumu ile ayrılır. Bu yöntem ile yetiştirilen nöronlar yüksek çözünürlüklü optik görüntüleme ve işlevsel tahliller için uygundur.

Abstract

kültür içinde tek tek sinir hücrelerinin yapısı ve fizyolojisi sonda yeteneği nörobiyolojisinin çalışma için çok önemlidir, ve tek tek hücreler veya tanımlanmış ağlar genetik ve kimyasal manipülasyonu esnekliğe olanak sağlamaktadır. sağlam beyin doku ile karşılaştırıldığında manipülasyon gibi kolaylığı düşük kültür sisteminde daha basittir. Bu birincil nöronların izolasyonu ve büyümesi için birçok yöntemler varsa da, her biri kendi sınırlamaları vardır. Bu protokol daha sonra glial hücrelerin tek bir tabakası üzerinde asılı duran cam lameller, düşük yoğunluklu ve yüksek saflıkta kemirgen embriyonik hippokampal nöronlar yetiştirmek için kullanılan bir yöntem tarif eder. Bu 'sandviç kültürü' altta yatan glial tek tabaka trofik destek için izin verirken nöronların nüfusu münhasır uzun vadeli büyüme için izin verir. nöronlar yeterli yaş ve olgunluk seviyesi olduğunda, nöron lamelleri glial çanak Çıkış ters çevrilmekte ve görüntüleme ya da işlevsel tahlillerde kullanılabilir. Nöronlar gBu yöntemle rown genellikle birkaç hafta boyunca hayatta ve kapsamlı milleri, sinaptik bağlantıları ve ağ özelliklerini geliştirir.

Introduction

Beyin nöronların karmaşık ağlar halinde düzenlenmiştir. ağ etkinliği ve beyin fonksiyonu için bireysel nöronların katkı molekül bileşimi ve bunların fizyolojik özelliklerinin perturbance seçici değiştirilmesi ile incelenebilir. bireysel nöronların genetik ve kimyasal işleme sonrakinin hücresel heterojenlik ve karmaşıklığı ile serbest, sağlam beyin dokusunda daha kültüre edilmiş nöronlarda muhtemelen daha kolaydır. kültürde Nöronlar iyi tanımlanmış aksonal ve dendritik milleri geliştirmek ve birbirleriyle kapsamlı sinaptik bağlantıları oluşturur.

Yetişkin hayvanların veya sinir sisteminin diğer bölgelerden nöron kültürü mümkün olsa da, embriyonik hippokampal kültürler sık sık tarif piramidal hücre popülasyonu ve nispeten düşük glial yoğunluğu 1, 2 nedeniyle tercih edilir. kültürde düşük yoğunlukta yetiştirilir hipokampal nöronlar bilhassa ame olanalt hücresel lokalizasyonu, protein değiş tokuşunu, nöronal polarite ve sinaps gelişimini çalışmaya nable. Kültür nöronlar da kapsamlı sinaptik plastisite 3, 4, 5, 6, moleküler süreçler üzerinde çalışılması olarak kullanılmıştır. Doğum sonrası hayatta olmayan küresel genetik delesyonu olan farelerden alınan Nöron kültürü hazırlıkları belli genlerin 7 hücresel ve sinaptik roller okuyan özellikle yararlıdır olmuştur.

Beyinde gibi, kültürlenmiş hipokampal nöronlar glial hücrelerden trofik desteğine bağlıdır. Bu kendi kültür zorlaştırmaktadır ve bu destek verilir hangi birkaç farklı yöntemlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Yaygın olarak kullanılan bir yöntem, glial hücreler 8 ya da edinilmiş Hipp kirletici glial hücreler sağlayan bir tek tabaka üzerine direkt olarak nöronlar kaplama içerirocampal doku çoğalır ve nöronlar 9 altında bir tek katman oluşturmak için. Bu yöntem bazı başarılar sağlamasına rağmen, ortaya çıkan nöronal kültürün kirlilik görüntüleme deneyleri için sakıncalıdır. Nöron kültürü Bir başka sık kullanılan yöntem, tamamen tabaka glial besleyici Çıkış bırakın ve bunun yerine belirli bir büyüme ortamında 10 şeklinde trofik destek sağlamaktır.

Burada, "sandviç" ya da nöron kültürü 2, 11 "Banker" yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, daha sonra parafin mumu ile ayrılmış, glial hücrelerin tek bir tabakası üzerinde asılı duran cam lameller üzerinde hipokampal nöronlar kaplama içerir. Bu altta yatan glial tek tabaka trofik destek için izin verirken glia kirletmeden nöronların homojen nüfusun uzun vadeli kültürü kolaylaştırır. Nöronlar yeterli yaş ve olgunluk düzeyine ait olduğunda,nöron lamelleri-çevrilmiş üzerinden glial çanak ve görüntüleme ya da işlevsel tahlillerde kullanılabilir.

Protocol

Tüm deneyler ve laboratuar hayvanları kullanarak protokolleri Manitoba Üniversitesi Hayvan Etik Kurulu tarafından onaylandı ve Hayvan Bakımı Kanada Konseyi yönergelerine uyumlu idi. Aletler, Tamponlar ve Solüsyonlar 1. Solüsyonun hazırlanması a tüm diseksiyon ekipman, cam Pasteur pipet, pipet uçları, filtre düzeneği ve deiyonize su otoklav ile sterilize edin. iyonu giderilmiş su ve filtre-sterilize stok glukoz çözeltisi,% 20 (1.1 M / h) hazırlayın. …

Representative Results

Birincil sinir hücresi kültürünün bu "sandviç" yönteminde, hipokampal nöronlar (Şekil 3) parafin boncuklar (Şekil 2) ile ayrılan glial hücreler (Şekil 1) bir yatakta büyür. Bu nöronlar selektif asgari glial hücre kontaminasyonu ile cam lameller üzerinde büyüyecek ama doku kültürü çanak büyüyen glia yeterli trofik destek almasını sağlamaktadır. Tipik olarak, nöronlar> 3 hafta kültür içinde mu…

Discussion

Kültürleme nöronların "sandviç" yöntemi başka yerlerde iyi anlatılmış olmasına rağmen 2, 11, bunu kabul etmek isteyen araştırmacılar için hayal kırıklığı yol açabilir sadece metin olarak tarif etmek oldukça zordur protokol boyunca çeşitli adımlar vardır.

Glial kültür, lamel hazırlanması ve nöron kültürü ve bakım: yöntem, üç ana iş akışları ayrılabilir. Üç hazırlıkları Her ak?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma CIHR MOP-142209 TJs için destek verdi.

Materials

Dissection Instruments
Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5910
Micro Dissecting Spring Scissors Roboz RS-5650
Micro Dissecting Spring Scissors Roboz RS-5605
Dumont Forceps (#5) Roboz RS-5045
Dumont Forceps (#PP) Roboz RS-4950
Name Company Catalog Number Comments
Tissue Preparation
Trypsin (2.5%) Gibco 15-090-046
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25-200-072
Swinnex Filter Holder, 25 mm EMD Millipore SX0002500 Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave
Isoflorane Pharmaceutical Partners of Canada Inc. CP0406V2
Hemocytometer Hausser Scientific 1492
Grade 105 Lens Cleaning Tissue GE Healthcare 2105-841 Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave
Glass Pasteur pipettes with cotton filter VWR 14672-412
HEPES (1 M) Gibco 15-630-080
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) Gibco 14-185-052
Glass Pasteur pipettes VWR 14672-380
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) Sigma-Aldrich DN25-100mg
Butane bunsen burner Wall-Lenk Mfg. Co. Model 65
Centrifuge Eppendorf 5810R
Name Company Catalog Number Comments
Tissue Culture
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15-140-122
Petri Dish (100 mm) Fisher FB0875712
Petri Dish (60 mm) Fisher FB0875713A
Horse Serum Gibco 16050-122 Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended.  
Sodium Hydroxide Fisher Scientific S318-1
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Minimum Essential Medium (MEM) Gibco 11-095-080
Neurobasal Medium Gibco 21-103-049
L-Glutamine (200 mM) Gibco 25-030-081
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium
Culture Dish (60 mm) Corning, Inc 353002
Culture Flasks (75 cm^2) Greiner Bio-One 658170
Cytarabine (Ara-C) Sigma-Aldrich C3350000
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Bovine Growth Serum (BGS) HyClone SH3054103 Heat-inactivation is recommended before use.
B27 Supplement (50x) Gibco 17-504-044
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418-100ml
Cryogenic Vials VWR 89094-806
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) Sigma-Aldrich A5282
Name Company Catalog Number Comments
Coverslip Preparation
Sodium tetraborate decahydrate (borax) Sigma-Aldrich B9876-1KG
Poly-L-Lysine Hydrobromide Sigma-Aldrich P2636
Histoplast Paraffin Wax Fisher 22-900-700
Gravity Convection Oven VWR 89511-404 Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Ultrasonic Bath (Sonicator) Fisher Scientific 15337400
Nitric Acid Anachemia 62786-460
Ceramic Staining Racks Thomas Scientific 8542E40 Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol
Coverslips Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH 1001/18 Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass 
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252
Name Company Catalog Number Comments
Miscellaneous
Sterile Syringe Filters VWR 28145-477 Used with BD syringe for filter-sterilization
Syringe  BD 302832 Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization
Water Bath Fisher Scientific 15-460-16Q
Inverted Microscope Olympus CKX41
15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoScientific 339650
50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes ThermoScientific 339652

Referências

  1. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  3. Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons–views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
  4. Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
  5. Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
  6. Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
  7. Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
  8. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  9. Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
  10. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
  11. Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
  12. Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).

Play Video

Citar este artigo
Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. J. Vis. Exp. (122), e55000, doi:10.3791/55000 (2017).

View Video