Denna artikel beskrivs det protokoll för odling av låg densitet primära hippocampusneuroner växer på täckglas av glas inverterade över en glial monoskikt. Neuron och gliaceller skikten separeras av paraffin vaxpärlor. Neuronerna odlas genom detta förfarande är lämpliga för hög upplösning optisk avbildning och funktionella analyser.
Förmågan att sondera struktur och fysiologi av individuella nervceller i kultur är avgörande för studier av neurobiologi, och tillåter flexibilitet i genetisk och kemisk manipulation av enskilda celler eller definierade nätverken. Sådan lätthet för manipulation är enklare i den reducerade odlingssystemet jämfört med den intakta hjärnvävnad. Medan många metoder för isolering och tillväxt av dessa primära nervceller existerar, har varje sina egna begränsningar. Detta protokoll beskriver ett förfarande för odling låg densitet och hög renhet gnagare embryonala hippocampusneuroner på täckglas, som sedan är upphängda över ett monoskikt av gliaceller. Denna 'sandwich kultur' möjliggör för exklusiv långsiktig tillväxt av en population av nervceller samtidigt för trofiska stöd från den underliggande gliaceller monolager. När neuroner är av tillräcklig ålder eller mognad, kan de neurontäckglas vändas ut av gliaceller skålen och används i avbildning eller funktionella analyser. neuroner grown genom denna metod överleva typiskt under flera veckor och utveckla omfattande hållare, synaptiska förbindelser och nätverksegenskaper.
Hjärnan är organiserad i intrikata nätverk av nervceller. kan studeras bidraget av enskilda nervceller till nätverksaktivitet och hjärnans funktion genom selektiv förändring av deras molekylära sammansättning och perturbance av deras fysiologiska egenskaper. Genetisk och kemisk manipulation av enskilda nervceller är utan tvekan lättare i odlade nervceller än intakt hjärnvävnad, kompliceras av den senare cellulära heterogenitet och komplexitet. Neuroner i odling utvecklas väldefinierad axonal och dendritiska hållare och bildar omfattande synaptiska anslutningar med varandra.
Medan neuron kultur från vuxna djur eller från andra regioner i nervsystemet är möjlig, är embryonala hippocampusodlingar ofta föredragna på grund av deras definierade pyramidal cellpopulation och relativt låg gliala densitet 1, 2. Hippocampusneuroner odlade vid låg densitet i odling är särskilt ameNable att studiet av subcellulära lokalisering, protein trafficking, neuronal polaritet och synaps utveckling. Neuroner i kultur har också i stor utsträckning använts för att studera molekylära processer i synaptisk plasticitet 3, 4, 5, 6. Neuron kultur preparat från möss med globala genetiska deletioner som inte överlever efter födelsen har varit särskilt användbart för att studera cellulära och synaptiska roller vissa gener 7.
Såsom i hjärnan, odlade hippocampala neuroner är beroende av trofisk stöd från gliaceller. Detta försvårar deras kultur, och har lett till utvecklingen av flera olika metoder genom vilka detta stöd levereras. En vanligen använd metod inbegriper plätering neuroner direkt på ett monoskikt av gliaceller 8, eller gör det kontaminerande gliaceller från det förvärvade hippocampal vävnad för att proliferera och bilda ett monoskikt under neuron 9. Även om denna metod har funnit en viss framgång, är den förorening av den resulterande neuronal kultur ofördelaktigt för avbildning experiment. En annan vanligen använd metod för neuron kultur är att lämna ut gliaceller matarskikt helt och hållet, och istället tillhandahålla trofiskt stöd i form av ett definierat tillväxtmedium 10.
Här beskriver vi "sandwich" eller "Banker" metod för neuron kultur 2, 11. Denna metod innefattar utstrykning av hippocampala neuroner på täckglas, som sedan är upphängda över ett monoskikt av gliaceller åtskilda av paraffin vaxpärlor. Detta underlättar långvarig odling av en homogen population av nervceller utan att förorena glia samtidigt för trofiska stöd från den underliggande gliaceller monolager. När nervceller är tillräckligt ålder eller mognad,neuron täckglas kan fällas ut av gliaceller skålen och används i avbildning eller funktionella analyser.
Medan "sandwich" -metoden att odla nervceller har väl beskrivna på annat håll 2, 11, finns det flera steg under protokollet som är ganska svårt att beskriva i text ensam, vilket kan leda till frustration för utredare som vill anta den.
Metoden kan delas in i tre breda arbetsflöden: gliaceller kultur, täckglas beredning och neuron kultur och underhåll. Var och en av de tre preparaten är avgörande för högkvalitat…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av CIHR MOP-142.209 till TJS.
Dissection Instruments | |||
Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Preparation | |||
Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Tissue Culture | |||
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Coverslip Preparation | |||
Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Miscellaneous | |||
Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |