कम घनत्व प्राथमिक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन संस्कृति
Summary
यह लेख कम घनत्व प्राथमिक हिप्पोकैम्पस एक glial monolayer पर उल्टे कांच coverslips पर बढ़ रही न्यूरॉन्स संवर्धन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है। न्यूरॉन और glial परतों पैराफिन मोम मोती से अलग होती है। इस विधि की वृद्धि हुई न्यूरॉन्स उच्च संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग और कार्यात्मक assays के लिए उपयुक्त हैं।
Abstract
संस्कृति में संरचना और व्यक्तिगत तंत्रिका कोशिकाओं के शरीर क्रिया विज्ञान की जांच करने की क्षमता तंत्रिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, और व्यक्तिगत कोशिकाओं या परिभाषित नेटवर्क के आनुवंशिक और रासायनिक हेरफेर में लचीलेपन के लिए अनुमति देता है। जब बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में हेरफेर के इस तरह के आराम कम संस्कृति प्रणाली में सरल है। जबकि अलगाव और इन प्राथमिक न्यूरॉन्स के विकास के लिए कई तरीके मौजूद हैं, प्रत्येक की अपनी सीमाएं हैं। यह प्रोटोकॉल कांच coverslips, जो तब glial कोशिकाओं की एक monolayer से अधिक निलंबित कर रहे हैं पर कम घनत्व और उच्च शुद्धता कृंतक भ्रूण हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स संवर्धन के लिए एक विधि का वर्णन है। यह 'सैंडविच संस्कृति' न्यूरॉन्स की आबादी के अनन्य दीर्घकालिक विकास, जबकि अंतर्निहित glial monolayer से पौष्टिकता संबंधी सहायता के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति देता है। न्यूरॉन्स पर्याप्त उम्र या परिपक्वता के स्तर के होते हैं, तो न्यूरॉन coverslips फ़्लिप बाहर किया जा सकता है glial पकवान की और इमेजिंग या कार्यात्मक assays में इस्तेमाल किया। न्यूरॉन्स जीइस विधि द्वारा rown आम तौर पर कई हफ्तों के लिए जीवित रहते हैं और व्यापक arbors, synaptic कनेक्शन, और नेटवर्क गुण का विकास।
Introduction
मस्तिष्क न्यूरॉन्स के जटिल नेटवर्क में आयोजित किया जाता है। नेटवर्क गतिविधि और मस्तिष्क समारोह के लिए अलग-अलग न्यूरॉन्स के योगदान उनके आणविक संरचना और उनकी शारीरिक गुणों की perturbance के चुनिंदा परिवर्तन द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की आनुवंशिक और रासायनिक हेरफेर बरकरार मस्तिष्क के ऊतकों की तुलना में सुसंस्कृत न्यूरॉन्स में यकीनन आसान है, बाद के सेलुलर विविधता और जटिलता द्वारा अभारग्रस्त है। संस्कृति में न्यूरॉन्स अच्छी तरह से परिभाषित axonal और वृक्ष के समान arbors को विकसित करने और एक दूसरे के साथ व्यापक synaptic कनेक्शन के रूप में।
जबकि वयस्क जानवरों से या तंत्रिका तंत्र के अन्य क्षेत्रों से न्यूरॉन संस्कृति संभव है, भ्रूण हिप्पोकैम्पस संस्कृतियों अक्सर उनके परिभाषित पिरामिड सेल आबादी और अपेक्षाकृत कम glial घनत्व 1, 2 की वजह से पसंद किया जाता है। हिप्पोकैम्पस संस्कृति में कम घनत्व से वृद्धि हुई न्यूरॉन्स विशेष रूप से एएमई हैंsubcellular स्थानीयकरण, प्रोटीन की तस्करी, न्यूरोनल polarity और अन्तर्ग्रथन विकास के अध्ययन के लिए nable। संस्कृति में न्यूरॉन्स भी बड़े पैमाने पर अन्तर्ग्रथनी plasticity 3, 4, 5, 6 में आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने में नियोजित किया गया है। वैश्विक आनुवंशिक विलोपन कि postnatally जीवित नहीं है के साथ चूहों से न्यूरॉन संस्कृति की तैयारी कुछ जीनों 7 के सेलुलर और synaptic भूमिकाओं का अध्ययन करने में विशेष रूप से उपयोगी किया गया है।
मस्तिष्क में के रूप में, सुसंस्कृत हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स glial कोशिकाओं से पौष्टिकता समर्थन पर निर्भर हैं। यह उनकी संस्कृति पेचीदा हो, और कई अलग अलग तरीके है जिसके द्वारा इस समर्थन आपूर्ति की है के विकास के लिए प्रेरित किया है। एक आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि सीधे न्यूरॉन्स चढ़ाना glial कोशिकाओं 8, या प्राप्त हिप से दूषित पदार्थों को glial कोशिकाओं की इजाजत दी की एक monolayer पर शामिलocampal ऊतक पैदा करना और न्यूरॉन्स 9 के नीचे एक monolayer फार्म करने के लिए। इस विधि कुछ सफलता मिली है, जिसके परिणामस्वरूप न्यूरोनल संस्कृति की अशुद्धता इमेजिंग प्रयोगों के लिए हानिकर है। न्यूरॉन संस्कृति का एक और आमतौर पर इस्तेमाल किया विधि छोड़ आउट करने के लिए glial फीडर पूरी तरह परत और इसके बदले एक परिभाषित विकास माध्यम 10 के रूप में पौष्टिकता संबंधी सहायता प्रदान करता है।
यहाँ, हम "सैंडविच" या न्यूरॉन संस्कृति 2, 11 के "बैंकर" विधि का वर्णन। इस विधि कांच coverslips, जो तब पैराफिन मोम मोती द्वारा अलग glial कोशिकाओं की एक monolayer से अधिक निलंबित कर रहे हैं पर हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स चढ़ाना शामिल है। यह glia contaminating जबकि अंतर्निहित glial monolayer से पौष्टिकता संबंधी सहायता के लिए अनुमति के बिना न्यूरॉन्स की एक समरूप जनसंख्या का लंबे समय तक संस्कृति की सुविधा। न्यूरॉन्स पर्याप्त उम्र या परिपक्वता के स्तर के होते हैं,न्यूरॉन coverslips फ़्लिप बाहर किया जा सकता है glial पकवान की और इमेजिंग या कार्यात्मक assays में इस्तेमाल किया।
Protocol
Representative Results
Discussion
संवर्धन न्यूरॉन्स की "सैंडविच" विधि कहीं और अच्छी तरह से वर्णित किया गया है 2, 11, वहाँ है कि अकेले पाठ में वर्णन करने के लिए काफी मुश्किल हो जाता है प्रोटोकॉल भर कई कदम है, जो जांचक…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम CIHR एमओपी-142,209 TJS करने द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
Referências
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- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
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- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
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- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
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