उच्च संकल्प मात्रात्मक Synaptic Proteome माउस मस्तिष्क क्षेत्रों की रूपरेखा श्रवण भेदभाव सीखने के बाद
Summary
The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.
Abstract
The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.
Introduction
लर्निंग स्मृति निशान और उनके रखरखाव के गठन पर आधारित है। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया है कि एक अंतर्निहित तंत्र न्यूरॉन्स के बीच मौजूदा synaptic संपर्कों के नए और / या पुनर्व्यवस्था की गतिविधि पर निर्भर गठन का प्रतिनिधित्व कर सकते। आणविक स्तर पर, विभिन्न प्रोटीन संशोधनों, subcellular relocalizations और synaptic प्रोटीन के कारोबार में परिवर्तन 1-4 (Lamprecht 2004 # 8) वर्णित किया गया है। हालांकि, ज्यादातर अध्ययनों से अब तक नहीं बल्कि वैश्विक लेकिन जटिल synaptic proteome रचना पर की तुलना में चयनित प्रोटीन पर ध्यान केंद्रित किया। वर्तमान दृष्टिकोण एक सीखने प्रयोग के बाद माउस मस्तिष्क क्षेत्रों में synaptic proteome परिवर्तन के लिए एक निष्पक्ष जांच की अनुमति देता है। यह synaptic वास्तुकला के सीखने प्रेरित पुनर्गठन के समय बिंदु निर्भर आणविक स्नैपशॉट प्रस्तुत करने के लिए उपयुक्त है। वर्णित कार्यप्रवाह पशुओं के व्यवहार, प्रोटीन जैव रसायन, मास स्पेक्ट्रोमेट्री और bioi में विभिन्न विशेषज्ञों की एक विशेष टीम वर्क की आवश्यकता हैnformatics।
चुने सीखने प्रतिमान, यानी आवृत्ति संग्राहक स्वर भेदभाव (FMTD), एक अच्छी तरह से विशेषता मूषक 5 में श्रवण भेदभाव कार्य है। लर्निंग और इस शटल बॉक्स जाने / में दीर्घकालिक स्मृति गठन नहीं जाओ-कार्य में वृद्धि हुई cortical डोपामाइन संकेतन और प्रोटीन संश्लेषण के आधार पर तंत्र शामिल है। तदनुसार, gerbils और चूहों पर हाल ही में प्रोटिओमिक पढ़ाई के dopamine- और cortical में synaptic घटकों के सीखने प्रेरित प्लास्टिक rearrangements, लेकिन यह भी अधिक बेसल मस्तिष्क क्षेत्रों माना जाता है कि FMTD सीखने और स्मृति 6-8 दौरान बातचीत में पता चला। यह दिखाता है कि स्मृति गठन मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों की एक जटिल परस्पर क्रिया शामिल है और इस प्रकार, विभिन्न proteome स्तर पर इन क्षेत्रों के भीतर नियंत्रित किया जा सकता है। इसलिए, चयनित cortical और subcortical माउस मस्तिष्क क्षेत्रों के विच्छेदन कार्यप्रवाह में शामिल है।
इसके अलावा, विश्वसनीय characterizatiयहां तक कि synaptic प्रोटीन संरचना में कमजोर परिवर्तन की बजाय homogenates या कच्चे तेल की झिल्ली अंशों 9 के विश्लेषण के पूर्व और postsynaptic डिब्बों में से एक संवर्धन की आवश्यकता है। इसलिए, synaptosomes की तैयारी की स्थापना का उपयोग प्रोटोकॉल प्रोटिओमिक विश्लेषण करने से पहले आदेश का पता लगाने के स्तर पर और अन्तर्ग्रथन-विशिष्ट प्रोटीन 10,11 के लिए गतिशील रेंज बढ़ाने के लिए वर्णित है।
मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए लेबल मुक्त उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने के लिए एक आवश्यक शर्त प्रोटीन के नमूने की समानता के एक उच्च डिग्री है। जैसा कि synaptic प्रोटीन संरचना में नहीं बल्कि मामूली परिवर्तन सीखने, एक लेबल मुक्त दृष्टिकोण इसी प्रशिक्षित और भोले चूहों से प्राप्त प्रोटीन के नमूने की तुलना करना उचित होगा के बाद होने की उम्मीद कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, स्थिर आइसोटोप (जैसे टीएमटी, iTRAQ, आईसीपीएल और SILAC) के साथ ही MS2 आधारित लेबल मुक्त योग्यता के रूप में उपयोग करते हुए प्रोटीन / पेप्टाइड्स की हालत-विशिष्ट लेबल रणनीतियोंntification (पट्टी) उपयोगी होते हैं, लेकिन वे चुना लेबल मुक्त दृष्टिकोण की तुलना में अधिक महंगे हैं या विशेष बड़े पैमाने पर spectrometric हार्डवेयर की जरूरत है।
प्रोटिओमिक स्क्रीनिंग अक्सर जटिल डेटा सेट उपज के बाद से, bioinformatic प्रसंस्करण उपयुक्त डेटा व्याख्या के लिए सिफारिश की है। अतिरिक्त मेटा-विश्लेषण संभावित आणविक प्रतिमान से संबंधित परिवर्तन और इसमें शामिल कुंजी सेलुलर प्रक्रियाओं और संकेत रास्ते की पहचान अंतर्निहित तंत्र की एक बेहतर समझ समर्थन कर सकते हैं। उचित तरीके भी नीचे वर्णित हैं।
Protocol
पशु विषयों सहित सभी प्रक्रियाओं जर्मन संघीय कानून, संबंधित यूरोपीय संघ के नियमों और दिशा निर्देशों एनआईएच के नियमों के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे, और Landesverwaltungsamt साचसेन / एनहाल्ट (42502-2-1102 IFN) की आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है। 1. श्रवण लर्निंग शटल बॉक्स (FMTD प्रतिमान) नोट में श्रवण भेदभाव सीखने: जबकि चूहों से निपटने हमेशा दस्ताने पहनते हैं। स्पष्ट पॉली कार्बोनेट पिंजरों में नल के पानी खाना छर्रों के लिए स्वतंत्र पहुँच और के साथ तीन या चार समूहों में सदन C57BL6 / जम्मू चूहों। जानवरों की सुविधा में अंधेरे चक्र: एक 12 घंटा प्रकाश बनाए रखें। जानवरों के एक और प्रयोगशाला से या एक कंपनी से प्राप्त कर रहे हैं दशानुकूलन के कम से कम एक सप्ताह के लिए अनुमति देते हैं और में बसने। प्रति दिन एक शटल बॉक्स प्रशिक्षण सत्र का प्रदर्शन। जानवरों की सुविधा में अपने घर पिंजरे से माउस ले लो और एक साउंड प्रूफ कक्ष के भीतर एक dimly जलाया शटल बॉक्स में जगह है। श्रवण भेदभाव सीखने के लिए एक पूरी तरह से कंप्यूटर नियंत्रित सीखने अनुसूची का प्रयोग करें। मौन के 3 मिनट की एक आदी होना अवधि के साथ शुरू, और फिर प्रशिक्षण सत्र शुरू करते हैं। बढ़ती टोन के दृश्यों का उपयोग (4 – 8 किलोहर्ट्ज़, सीएस +) गो-परीक्षणों के दौरान जाने-प्रोत्साहन के रूप में: पशु (सही जवाब, हिट) स्वर प्रस्तुति के 6 सेकंड के भीतर की बाधा पार करना पड़ता है। 300 μA, शटल बॉक्स के ग्रिड मंजिल के माध्यम से वितरित – 50 के एक हल्के पैर सदमे से एक मिस सज़ा। पशु स्वर प्रस्तुति के 6 सेकंड के दौरान शटल बॉक्स की वर्तमान डिब्बे में रहने के लिए है: के दौरान कोई-जाना परीक्षणों नहीं जाओ प्रोत्साहन के रूप में – (4 किलोहर्ट्ज़, सीएस 8) गिरने स्वर के दृश्यों का प्रयोग करें। 300 μA, शटल बॉक्स के ग्रिड मंजिल के माध्यम से वितरित – 50 के एक हल्के पैर सदमे से एक झूठा अलार्म सज़ा। 20 5 सेकंड के अंतराल intertrial का प्रयोग करें। , एक छद्म यादृच्छिक क्रम में 30 गो-परीक्षणों और प्रति सत्र 30 नहीं, गो-परीक्षणों को पूरा करें ताकि एक एसईssion 60 परीक्षणों के होते हैं और लगभग 25 मिनट तक रहता है। प्रशिक्षित पशु जानवरों की सुविधा में अपने घर पिंजरे में वापस डाल दिया। ब्रेन विच्छेदन ग्रीवा अव्यवस्था (प्रथम सत्र के पूरा होने के बाद जैसे 24 घंटा) का उपयोग प्रशिक्षण सत्र का एक वांछित संख्या के बाद वांछित समय बिंदु पर पशु euthanize। पशु सिर काटना। कट पहले त्वचा और फिर Sutura sagittalis साथ सीधे कैंची के साथ खोपड़ी: जल्दी से निम्नलिखित कदम के माध्यम से मस्तिष्क काटना। पूरी तरह से हड्डी जो मजबूत संदंश का उपयोग मस्तिष्क के ऊतकों को कवर के कुछ हिस्सों को हटा दें। एक spattle के साथ मस्तिष्क बाहर ले जाओ। विच्छेदन के लिए, बर्फ से भरा एक पेट्री डिश पर मस्तिष्क जगह है। श्रवण प्रांतस्था, ललाट प्रांतस्था, स्ट्रिएटम और एक stereomicroscope के तहत हिप्पोकैम्पस एक छुरी और एक सुई का उपयोग काटना। मस्तिष्क रों पर दृश्य स्थलों का उपयोग कर श्रवण प्रांतस्था स्थानीय बनानाजैसे रक्त वाहिकाओं और सतह के आकार (-2.06 शीर्षस्थान -3.4 करने के लिए, आकार rostrocaudal 2 मिमी, dorsoventral 1.3 मिमी) और द्विपक्षीय कोर्टेक्स की मोटाई के साथ एक आयताकार ऊतक ब्लॉक के रूप में काटना रूप urface। एक मील का पत्थर के रूप में chiasma opticum का उपयोग कर और कन्द olfactorius से ऊतक को छोड़कर शीर्षस्थान 3.56 और 1.54 के बीच एक मस्तिष्क टुकड़ा के रूप में ललाट प्रांतस्था काटना। शीर्षस्थान 1.54 और 0.5 के बीच एक मस्तिष्क टुकड़ा के रूप में स्ट्रिएटम काटना और ध्यान से cortical ऊतक को हटा दें। सेरिबैलम के माध्यम से सुई के साथ मस्तिष्क फिक्सिंग और कोर्टेक्स पश्चकपाल पालि पर शुरू uncoiling द्वारा हिप्पोकैम्पस काटना। शॉक फ्रीज -80 डिग्री सेल्सियस पर तरल नाइट्रोजन और दुकान में मस्तिष्क के नमूने विच्छेदित। 2. synaptosomes की तैयारी या वैकल्पिक रूप से एक पोस्टअन्तर्ग्रथनी घनत्व (PSD) -enriched अंश नोट: – 4 डिग्री सेल्सियस सभी प्रक्रियाओं के दौरान, 0 पर नमूने और buffers रहते हैं।बफ़र हौसले आदेश प्रोटीन के proteolytic गिरावट को रोकने के लिए protease अवरोध कॉकटेल पतला होते हैं। प्रोटीन phosphorylation का भी अध्ययन किया जाता है, फॉस्फेट अवरोध कॉकटेल जोड़ा जाना है। सभी जी-मूल्यों संकेत दिया जी (औसत) पूरे प्रोटोकॉल भर के रूप में दिया जाता है। एक कच्चे झिल्ली अंश की तैयारी (चित्रा 3) स्थानांतरण विच्छेदित 1 मिलीलीटर बर्फ युक्त एक homogenization के बर्तन में मस्तिष्क के ऊतकों ए (5 मिमी HEPES, 320 मिमी सूक्रोज, 7.4 पीएच) बफर और 12 स्ट्रोक के साथ 900 rpm पर ऊतक homogenize ठंड। 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र। supernatants रखें। पुनः homogenize 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर पहले के रूप में homogenization बफर के समान मात्रा में ही परिस्थितियों और सेंट्रीफ्यूज के नमूनों में छर्रों फिर से। इसी supernatants जुडा है। छर्रों P1, जो मुख्य रूप से नाभिक और सेल मलबे शामिल त्यागें। 12,000 एक्स जी 20 मिनट के लिए संयुक्त supernatants स्पिन। त्यागें supernatants या आगे विभाजन 11 के लिए इस्तेमाल करते हैं। 20 मिनट के लिए 12,000 XG पर 900 आरपीएम और स्पिन पर 6 स्ट्रोक के साथ homogenizer का उपयोग कर के रूप में पहले homogenization बफर के समान मात्रा में Resuspend छर्रों। त्यागें supernatants। छर्रों कच्चे तेल की झिल्ली अंशों का प्रतिनिधित्व p2। कच्चे मस्तिष्क की झिल्ली अंशों से synaptosomes की शुद्धि (चित्रा 3 ए) नोट: कच्चे मस्तिष्क की झिल्ली अंशों माइलिन, प्रकाश झिल्ली, synaptosomes और माइटोकॉन्ड्रिया सुक्रोज घनत्व कदम ढाल ultracentrifugation का उपयोग कर में विभाजित किया जा सकता है। इस 5 मिमी Tris / एचसीएल पीएच के लिए 8.1 या तो 0.32 एम, 1.0 एम या 1.2 मीटर एकाग्रता में सुक्रोज युक्त बफ़र्स आवश्यक हैं। centrifugation p2 के अंशों का उत्पादन करने के लिए प्रदर्शन कर रहा है, जबकि ultracentrifuge ट्यूबों में सुक्रोज कदम ढ़ाल तैयार करते हैं। 2.5 मिलीलीटर 1.0 एम सुक्रोज बफर और 1.5 मिलीलीटर 1.2 मीटर सुक्रोज बफर एक गिलास पाश्चर pipet का उपयोग के साथ उपस्तर साथ शुरू करो। पुनः homogenize p2 के अंशोंढाल के शीर्ष पर 0.32 एम सुक्रोज बफर 6 स्ट्रोक के साथ मैन्युअल और लोड के 0.5 मिलीलीटर में। एक ultracentrifuge एक झूलते बाल्टी रोटर का उपयोग करने में 2 घंटे के लिए 85,000 XG पर स्पिन। 1.0 एम सुक्रोज बफर (माइलिन, प्रकाश झिल्ली) के इंटरफेस में सामग्री सहित शीर्ष 0.32 एम सुक्रोज परत त्यागें। 1.0 / 1.2 मीटर सुक्रोज बफर इंटरफेस में synaptosomes लीजिए। ट्यूब के नीचे गोली माइटोकॉन्ड्रिया में शामिल है। 1 पर synaptosomal अंश के लिए 0.32 एम सुक्रोज बफर जोड़ें: 1 के अनुपात, 1 घंटे के लिए 150,000 XG पर ध्यान से और स्पिन मिश्रण। Synaptosomes गोली में हैं और अब एक बफर आगे की प्रक्रिया के लिए आवश्यक में resuspended जा सकता है। एक PSD-समृद्ध अंश की तैयारी (चित्रा 3 बी) 100 μl निष्कर्षण बफर में एक भी जानवर से प्रत्येक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र Homogenize (5 मिमी Tris / एचसीएल पीएच 8.1, 0.5% ट्राइटन X-100) एक PTFE (polytetrafluorethylene) मूसल के साथ एक 200 μl ultracentrifuge ट्यूब में12 स्ट्रोक के साथ 2,000 आरपीएम पर। 100 μL निष्कर्षण बफर जोड़ें, मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। 100,000 1 घंटे के लिए XG पर स्पिन और एक 200 μl pipet के साथ सावधानी से सतह पर तैरनेवाला एस 1 इकट्ठा। गोली P1 12 स्ट्रोक के साथ 2,000 rpm पर एक PTFE मूसल के साथ फिर से 100 μl निकासी बफर के साथ ही ट्यूब में पुन: homogenize। 100 μl निष्कर्षण बफर जोड़ें और 1 घंटे के लिए 100,000 XG पर एक पिपेट और स्पिन के साथ अच्छी तरह से मिला लें। घुलनशील प्रोटीन अंश के एस 1 के साथ सतह पर तैरनेवाला S2 जुडा है। यह अंश साइटोसोलिक प्रोटीन, 0.5% ट्राइटन X-100 घुलनशील झिल्ली प्रोटीन और बाह्य मैट्रिक्स अणुओं में शामिल है। 50 μl 5 मिमी Tris / एचसीएल पीएच 8.1 में शेष गोली Resuspend। यह अंश PSDs, डिटर्जेंट प्रतिरोधी झिल्ली, अघुलनशील cytoskeletal तत्वों, माइटोकॉन्ड्रिया और नाभिक सहित सेल मलबे में शामिल है। यह PSDs जो पोस्टअन्तर्ग्रथनी संरचनाओं के मूल रूप में, लेकिन यह भी प्रेस्य्नाप्तिक के महत्वपूर्ण भागों में समृद्ध हैसक्रिय क्षेत्र में cytomatrix। PSDs के संवर्धन के लिए कारक चारों ओर 4 और PSD घटकों के संवर्धन के पहले प्रदर्शन किया गया है। 12 3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयार सेल और नमूना सामान्यीकरण नोट: नमूना सामान्य बनाने के लिए प्रोटीन एकाग्रता के विषय में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम अंत में भी कमजोर synaptic प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन के लिए विश्वसनीय मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए है। synaptosomes या 20 में एक जानवर के प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र की PSD समृद्ध तैयारियों भंग – 50 μl (सामग्री की कुल राशि पर निर्भर: 5 के साथ श्रवण प्रांतस्था के लिए – 15 मिलीग्राम ऊतक का उपयोग 20 μl) 8 एम यूरिया की और 1 के लिए बर्फ पर सेते एक अल्ट्रासोनिक स्नान में घंटा। जेल में पचाने के लिए, synaptosomes एसडीएस नमूना बफर में सीधे भंग। ध्यान से जेल के अधिभार से बचने के लिए भरी हुई राशि की गणना। गौर है कि इस मामले में, उच्च प्रचुर मात्रा में पाड़ proteiएनएस जेल वैद्युतकणसंचलन के दौरान खो जाएगा और जेल में पचाने। एक हटाने योग्य डिटर्जेंट का 1% के साथ पतला 2 एम यूरिया के अंतिम एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए। 30 डिग्री सेल्सियस की तुलना में किसी भी तापमान अधिक से बचें प्रोटीन carbamylation रोकने के लिए। मानक प्रक्रियाओं 13,14 के अनुसार एक विभाज्य साथ एसडीएस पृष्ठ प्रदर्शन करना नमूने की (जैसे 10 μl)। Coomassie ब्लू निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार के साथ जेल दाग। प्रक्रिया मेथनॉल और एसिटिक एसिड के साथ फिक्सिंग और धुंधला कदम को जोड़ती है। प्रसारण विधा में एक calibrated जेल स्कैनर के साथ पूरे लेन के लिए प्रत्येक नमूने की ऑप्टिकल घनत्व का निर्धारण करते हैं और रिश्तेदार प्रोटीन राशि की गणना। इन गणनाओं के अनुसार नमूने मानक के अनुसार। दो अलग-अलग हिस्सों में प्रत्येक नमूना विभाजित। में समाधान डाइजेस्ट के लिए जेल में पचाने के लिए एक तिहाई और दो तिहाई का प्रयोग करें। में जेल पचाने <strong> जेल जुदाई एक दूसरे एसडीएस पृष्ठ एकाग्रता से समायोजित नमूने का उपयोग प्रदर्शन करना। दाग और सामान्य गुणवत्ता की जांच करने के लिए दूसरी बार जैल यों। विभिन्न क्षेत्रों (8 / लेन) में जेल के भीतर एक नमूना की प्रत्येक गली से बाहर कटौती, लेकिन ऊपर 170 केडीए आणविक वजन सीमा के बाहर। अलग ट्यूबों में जेल टुकड़े स्थानांतरण। एक तेज छुरी के साथ (लगभग। 1 एक्स 1 मिमी) छोटे टुकड़ों में काट लें क्षेत्रों में जेल पाचन प्रभावकारिता की सुविधा के लिए। डाइजेस्ट 15 50% acetonitrile (ACN) और 50 मिमी अमोनियम हाइड्रोजन कार्बोनेट (एनएच 4 HCO 3) से मिलकर एक बफर के 150 μl – जेल टुकड़े कई बार (धुंधला तीव्रता पर निर्भर करता है) 50 के साथ 10 मिनट के लिए धो लें। supernatants निकालें। ACN के साथ जेल टुकड़े कवर और 20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं जब तक जेल टुकड़े सफेद हो जाते हैं और सिकुड़ते है। ACN निकालें और 5 के लिए जेल टुकड़े rehydrate0.1 एम एनएच 4 HCO 3. के 50 μl के साथ मिनट एसीएन का एक ही मात्रा में जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे 15 मिनट के लिए सेते हैं। निकालें और पूरी तरह से तरल त्यागें। एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में जेल टुकड़े सूखी। 56 डिग्री सेल्सियस पर एनएच 4 HCO 3 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) और 45 मिनट के लिए गर्मी के नमूने युक्त के 50 μl में जेल टुकड़े rehydrate सिस्टीन अवशेषों को कम करने के लिए। Supernatants निकालें और कम हो cysteines carbamidomethylate को अंधेरे में 30 मिनट के लिए 50 μl एनएच 4 HCO 3 से युक्त 55 मिमी iodoacetamide (आईएए) जोड़ें। निकालें और जेल टुकड़े से ऊपर के सभी तरल त्यागने और उन्हें 50 μl एनएच 4 HCO 3 और एसीएन के साथ दो बार धोने (1: 1) किसी भी अवशिष्ट आईएए दूर करने के लिए 10 मिनट के लिए। एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में सूखी नमूने हैं। प्रोटीन के पाचन के लिए सीमित जोड़ने 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 trypsin के 12.5 एनजी / μl युक्त। आवश्यक मात्रा आकार और जेल पी की मात्रा पर निर्भर करता हैieces। कुछ मिनट के लिए सेते हैं और अगर बफर अवशोषित कर लेता है की जाँच करें। अधिक बफर जोड़ें यदि आवश्यक हो, जेल टुकड़े पूरी तरह से कवर किया जाना चाहिए। 37 डिग्री सेल्सियस रात भर (मि। 12 घंटा) पर सेते हैं। पेप्टाइड निष्कर्षण 10 के साथ ओवरले जेल टुकड़े – 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 के 20 μl और ACN का एक ही मात्रा में जोड़ें। अल्ट्रासोनिक स्नान का उपयोग कर बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। बाद में हटा दें और supernatants जो उत्पन्न पेप्टाइड्स के सबसे शामिल इकट्ठा। जेल टुकड़े करने के लिए 30% ACN / 0.1% trifluoroacetic एसिड (टीएफए) युक्त निकासी बफर के 100 μl जोड़ें। एक अल्ट्रासोनिक स्नान में ऊष्मायन दोहराएँ और ध्यान से इस सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा। 50% तक एसीएन एकाग्रता में वृद्धि से पिछले निकासी के चरणों को दोहराएँ। अल्ट्रासोनिक स्नान के 10 मिनट के बाद नीचे स्पिन और supernatants इकट्ठा। निकासी के सभी चरणों के तीन इसी supernatants का मिश्रण है और उन्हें एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में सूखी। ध्यान दें किजेल जुदाई प्रति लेन / नमूना 8 क्षेत्रों में इस कदम में फिर से एक नमूने के लिए संयुक्त रहे हैं का एक परिणाम के रूप में। In-समाधान को पचाने संग्रह गणना की राशि का उपयोग करने में कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृति के लिए पर्याप्त प्रारंभिक सामग्री प्राप्त करने के लिए सामान्यीकृत नमूनों की (जैसे एक 150 μl lysate के 100 μl, सामग्री की मात्रा और मात्रा एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र से एक नमूना के मेजबान के लिए की आवश्यकता पर निर्भर करता है) लेबल मुक्त मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रदर्शन करते हैं। 25 मिमी एनएच 4 HCO 3 में 2 मिमी डीटीटी जोड़ें और धीरे नमूना भंवर। 20 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए नमूने कम करें। 10 मिमी आई ए ए सिस्टीन अवशेषों carbamidomethylate में जोड़े। मिक्स और 20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए सेते हैं। अंत में, (25 मिमी एसिटिक एसिड में 1 माइक्रोग्राम / μl trypsin) एक trypsin शेयर समाधान के 1 μl जोड़ें और 12 घंटे के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) -Purification एसिड cleavable डिटर्जेंट निकालने के लिए, 1% टीएफए के अंतिम एकाग्रता के लिए नमूने को समायोजित करने और 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए सेते हैं। 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर और ध्यान से नमूने अपकेंद्रित्र supernatants इकट्ठा। एक रैक में विशेष कॉलम की जगह और 2 मिलीलीटर मेथनॉल के साथ मैट्रिक्स संतुलित करना। 2 (बफर बी) पानी में 0.1% TFA के मिलीलीटर के साथ दो बार धोएं। बफर बी के 2 मिलीलीटर जोड़ें और नमूना लोड। एक और तीन बार धोएं। 200 μl 70% ACN / 0.1% TFA जोड़कर पेप्टाइड्स Elute। इस चरण को दोहराएँ। दोनों eluates पूल और एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में उन्हें नीचे सूखी। फास्फो पेप्टाइड संवर्धन 2 Tio क्रोमैटोग्राफी 16 से 50 में 2 Tio मोतियों की जेल में या में समाधान 80% ACN / 2.5% TFA (बफर सी) के 150 μl में पचाने और संतुलित ~ 2 मिलीग्राम द्वारा उत्पादित पेप्टाइड्स भंगबफर सी के μl मोती 20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एक घूर्णन डिवाइस में नमूने के लिए जोड़ें और सेते हैं। बाद में, स्पिन नीचे मोती (16,000 XG, 1 मिनट) और supernatants इकट्ठा। धीरे मिश्रण और 5 मिनट के बाद नीचे कताई द्वारा मोती बफर सी के 100 μl के साथ तीन बार धोएं। supernatants लीजिए। क्रमश: 80% ACN / 0.1% TFA के 100 μl 0.1% TFA (ACN के बिना) के 100 μl के साथ तीन washes के द्वारा पीछा के साथ इस चरण को दोहराएँ, तीन बार। सभी दस supernatants का मिश्रण है, उन्हें एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में सूखी और उन्हें 3.5 चरण अनुसार आगे की शुद्धि के लिए phospho पेप्टाइड समाप्त अंश के रूप में संभाल। मोतियों से 400 मिमी एनएच 4 OH / 30% ACN के 20 μl के साथ ही phospho-पेप्टाइड्स Elute। इस कदम के तीन बार दोहराएँ और मोती नीचे कताई के बाद सभी supernatants इकट्ठा। की जेल में पचाने eluates का मिश्रण है और इन समाधान के लिए एक नमूना के डाइजेस्ट की और उन्हें phospho-पी के रूप में संभालeptide समृद्ध अंश। 8 μl – 4 के अंतिम मात्रा करने के लिए एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में उन्हें सूखी। ध्यान दे और सूक्ष्म एसपीई द्वारा phospho पेप्टाइड समाप्त अंशों की desalting 0.1% TFA के 20 μl में सूखे पेप्टाइड्स भंग। 20 μl टिप में ACN ड्राइंग द्वारा तय 18 सी मैट्रिक्स संतुलित करना। टिप में पानी में 0.1% TFA ड्राइंग द्वारा मैट्रिक्स धो लें। प्रक्रिया तीन बार दोहराएँ। धीरे-धीरे टिप में acidified नमूना लोड (इस कदम तीन बार दोहराने)। पानी में 0.1% TFA 20 μl के साथ सी 18 मैट्रिक्स तीन बार धोएं और धोने के समाधान त्यागें। बार बार (3 बार) 70% ACN के 20 μl / 0.1% ड्राइंग टीएफए से विंदुक टिप से पेप्टाइड्स Elute और एक अलग ट्यूब में इस क्षालन समाधान इकट्ठा। एक नमूने के eluates का मिश्रण है और उन्हें एक वैक्यूम अपकेंद्रित्र में सूखी। 4. proteome विश्लेषण <p> नोट: proteome विश्लेषण एक संकर दोहरे दबाव रैखिक आयन जाल / Orbitrap मास स्पेक्ट्रोमीटर एक अल्ट्रा एचपीएलसी के साथ सुसज्जित पर किया जाता है। एचपीएलसी एक 20 μl इंजेक्शन पाश के साथ एक ठंडा autosampler से बना है, एक द्विआधारी लोडिंग पंप (μl प्रवाह रेंज), एक द्विआधारी नैनो प्रवाह जुदाई पंप, स्विचिंग वाल्व और एक degasser दो सूक्ष्म साथ एक स्तंभ हीटर। नमूने सबसे पहले 7 μl / मिनट की एक प्रवाह की दर एक स्तंभ (उदाहरण के लिए 75 माइक्रोन x 25 सेमी) 250 nl / मिनट पर पर जुदाई के द्वारा पीछा किया पर एक फँसाने स्तंभ (उदाहरण के लिए 100 माइक्रोन x 2 सेमी) के अधीन हैं। जुदाई स्तंभ आउटलेट सीधे एक लेपित पिको emitter टिप मास स्पेक्ट्रोमीटर आयनीकरण स्रोत पर एक नैनो स्प्रे इंटरफेस में तैनात करने के लिए युग्मित है। नैनो तरल क्रोमैटोग्राफी और मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री कम से कम 30 मिनट के लिए 12 μl 2% ACN / 0.1% TFA में पेप्टाइड नमूने भंग। 15 सेकंड के लिए नीचे स्पिन और शीशियों (शंक्वाकार, कम diamete autosampler के लिए 11 μl सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरणआर)। को नियंत्रित करने के लिए सॉफ्टवेयर (जैसे, Xcalibur) के रूप में नमूना अनुप्रयोग, chromatographic जुदाई और मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए एक स्वचालित शासन को निर्धारित करें। Autosampler:: तापमान के लिए निम्नलिखित का उपयोग करें 5 डिग्री सेल्सियस; स्तंभ ओवन: 45 डिग्री सेल्सियस। वॉल्यूम:: इंजेक्शन के लिए निम्नलिखित का उपयोग 10 μl; दर प्रवाह: 7 μl / मिनट (2% ACN, 0.1% टीएफए); समय: 8 मिनट; वाल्व सेटिंग: जाल स्तंभ – अपशिष्ट; सामूहिक कल्पना अधिग्रहण: बंद। प्रवाह की दर: 250 nl / मिनट वाल्व की स्थापना: पृथक्करण के लिए निम्नलिखित का उपयोग जाल स्तंभ-जुदाई स्तंभ; सामूहिक कल्पना अधिग्रहण: पर। 0 मिनट – 100 मिनट: 2% ACN, 0.1% फार्मिक एसिड – 40% ACN, 0.1% फार्मिक एसिड 100 मिनट – 105 मिनट: 40% ACN, 0.1% फार्मिक एसिड – 95% ACN, 0.1% फार्मिक एसिड 105 मिनट – 109 मिनट: 95% ACN, 0.1% फार्मिक एसिड 109 मिनट – 120 मिनट: 2% ACN, 0.1% फार्मिक एसिड का प्रयोग मास स्पेक्ट्रोमेट्री सेटिंग्स के लिए निम्नलिखित: पूर्ण एमएस: FTMS; संकल्प 60,000; मी / z रेंज 400 – 2,000; सुश्री/एमएस: रैखिक Iontrap; न्यूनतम संकेत सीमा 500; अलगाव चौड़ाई 2 दा; गतिशील बहिष्कार समय 30 सेकंड की स्थापना; अकेले-आयनों का आरोप लगाया चयन से बाहर रखा गया है; सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा 10 मिसे के लिए 35% करने के लिए सेट है, और सक्रियण समय। नोट: एक पूर्ण एमएस स्कैन का उपयोग कर चलाता सबसे बहुतायत से पता चला पेप्टाइड आयनों की टक्कर प्रेरित-हदबंदी (सीआईडी) के लिए 15 LTQ एमएस / एमएस के बाद है। सभी नमूनों के लिए तीन तकनीकी प्रतिकृति चलाएँ। प्रोटीन की पहचान और लेबल मुक्त मात्रा का ठहराव प्रोटीन की पहचान और लेबल मुक्त मात्रा का ठहराव एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर सूट (जैसे, चोटियों स्टूडियो) के उपयोग की दिशा में प्रक्रिया बड़े पैमाने पर spectrometric कच्चे डेटा। अधिकांश अन्य proteome सॉफ्टवेयर संकुल के विपरीत इस विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है एक नए सिरे से -sequencing एल्गोरिथ्म प्रोटीन डेटाबेस संरेखण से पहले। हालांकि, इस कदम को आसानी से अन्य लोकप्रिय सॉफ्टवेयर संकुल द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है। उपयोग ईएसएसential 2 तालिका में सूचीबद्ध सेटिंग्स। फास्फो-प्रोटिओमिक्स ध्यान दें: कुशल और विश्वसनीय phospho पेप्टाइड अधिग्रहण प्रोटिओमिक कार्यप्रवाह की स्थापना के कुछ आवश्यक परिवर्तन की आवश्यकता है। phospho पेप्टाइड संवर्धन के बाद, कभी नहीं सूखी नमूने पूरी तरह से। हमेशा भंग नमूने रखें। नोट: फॉस्फोरिलेटेड threonines या serines की phospho एस्टर बंधन बहुत नाजुक है। आयन जाल इस फॉस्फेट का एक तटस्थ नुकसान में परिणाम के भीतर टक्कर प्रेरित विखंडन के दौरान। इस पेप्टाइड, जो बारी में पहचान के लिए आवश्यक है की किसी भी आगे विखंडन से बचाता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री सेटअप में अनुमति दी wideband सक्रियण फॉस्फेट समूह की एक तटस्थ नुकसान के बाद भी phospho-पेप्टाइड्स के विखंडन की अनुमति देता है। यह एक समय की बचत "छद्म एमएस 3" प्रदर्शन करती है। एमएस / एमएस डेटा में फास्फो साइट दृढ़ संकल्प एक विशेष सत्यापन और मूल्यांकन की आवश्यकता है और फोस्फोरस 3 से किया जा सकता है।0। 5. जैव सूचना विज्ञान – मेटा-विश्लेषण ध्यान दें: कार्यात्मक एनोटेशन और नेटवर्क विश्लेषण प्रदर्शन से पहले, प्रोटीन सूचियों preprocessed किया जाना है। सबसे पहले अलग से एक मस्तिष्क क्षेत्र के लिए विनियमित प्रोटीन और phospho-पेप्टाइड्स की सूची विलय। तब सब प्रत्येक अंश अशुद्ध अर्थ को रोकने के लिए UniProt-आईडी के डुप्लीकेट को हटा दें। GeneCodis 17 के साथ एकवचन संवर्धन विश्लेषण GeneCodis की वेब आधारित उपकरण को खोलें (http://genecodis.cnb.csic.es) जीव के रूप में "मस मस्कुलस" का चयन करें और "जैविक प्रक्रिया जाओ" एनोटेशन के रूप में। एक निश्चित अंश का UniProt-आईडी की एक सूची चस्पा करें। जमा करें और इंतजार जब तक विश्लेषण किया जाता है। पर "जाओ जैविक प्रक्रिया का एकवचन संवर्धन विश्लेषण" क्लिक करें और परिणाम देखें। अन्य तीन भागों के लिए दोहराएँ कदम 5.1.3। परिणाम सूचियों के बीच किसी भी दोहराव और चौराहों को देखने के लिएपर्ल या अजगर की तरह एक पटकथा भाषा का उपयोग डेटा की जरूरत फिल्टर करने के लिए। एक विलक्षण संवर्धन के विश्लेषण के लिए इसी तरह के उपकरणों डेविड (https://david.ncifcrf.gov/) और Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) प्लगइन्स बिंगो (http://apps.cytoscape.org/ साथ हैं क्षुधा / बिंगो) और ClueGO (http://apps.cytoscape.org/apps/cluego)। Gephi साथ GeneCodis डेटा के बाहर एक बल के आधार ग्राफ सृजन (https://gephi.org/) नोट: रेखांकन के लिए डेटा या तो एक ग्राफ प्रारूप (.gexf, .graphml, डॉट, .gv, .gml) या हाथ से प्रवेश किया में, उपयोगकर्ता द्वारा प्रदान किया गया है। ग्राफ नोड्स सृजन हाथ से ओपन Gephi और पर "डेटा प्रयोगशाला" पर क्लिक करें। नोड्स बनाएँ। "नोड्स" "नोड्स" तालिका करने के लिए स्विच करने के लिए छोड़ दिया पर क्लिक करें। "नोड जोड़ें" पर क्लिक करें। टर्म का नाम दर्ज करें। क्लिक करें "ठीक" / प्रेस दर्ज करें। वैकल्पिक: सहेजें GeneCodis पीसी के लिए परिणाम। एक स्प्रेडशीट कार्यक्रम के साथ .txt खोलें। सभी पंक्तियों उत्कृष्टता को हटाएँ"Item_Details" (अवधि नाम) से पीटी। परिवर्तन शीर्षक "लेबल" के लिए "Item_Details"। ".csv" के रूप में स्प्रेडशीट सहेजें। अब Gephi में, पर "आयात स्प्रेडशीट" पर क्लिक करें। Gephi की फ़ाइल ब्राउज़र से स्प्रेडशीट चुनें। अगला पर क्लिक करें"। "समाप्त" पर क्लिक करें। किनारों के माध्यम से नोड्स कनेक्ट। बाईं तरफ "किनारों" पर क्लिक करें "किनारों" तालिका करने के लिए स्विच करने के लिए। हर नोड (टर्म) के लिए: दूसरे शब्दों में जीन नामों को देखो। एक या एक से अधिक जीन साझा कर रहे हैं -> बढ़त बनाने। "एज जोड़ें" पर क्लिक करें। "अनिर्दिष्ट" का चयन करें। स्रोत और सूचियों ड्रॉप डाउन से बाहर लक्ष्य नोड का चयन करें। क्लिक करें "ठीक" / प्रेस दर्ज करें। एक से अधिक जीन साझा किया जाता है, "वजन" (टेबल) में बहुतायत दर्ज करें। सेना चित्रमय लेआउट आधारित है। ओपन ग्राफ डेटा फ़ाइल, ग्राफ प्रकार के "अनिर्दिष्ट" या डेटा का उपयोग के रूप में हाथ से प्रवेश किया सेट, "सारांश" पहले से ही चुने गए नहीं तो पर क्लिक करेंघ। interconnections की बहुतायत के आधार पर नोड्स का आकार बदलें। सांख्यिकी पर क्लिक करें, "नेटवर्क अवलोकन" के तहत या तो "औसत डिग्री" (अनिर्धारित किनारों) या "औसत। भारित डिग्री" (भारित किनारों) चलाते हैं। "सूरत" में, आकार बटन पर, "नोड्स" पर क्लिक करें तो अगले चुनें "गुण" और गुण पैरामीटर के लिए "औसत। भारित डिग्री" या "औसत डिग्री" की स्थापना की। लागू करें पर क्लिक करें। अंत: चुनें "सेना एटलस" "लेआउट" में और चलाने के लिए; बदल "प्रतिकर्षण ताकत" अगर नोड्स टकराने रहे हैं। चित्र के लिए निर्यात। स्क्रीनशॉट सुविधा: "सारांश", परिवर्तन ग्राफ लेआउट, धार मोटाई, लेबल आकार और "ग्राफ" खिड़की के नीचे मेनू के साथ स्केलिंग पर क्लिक करें। कैमरा छोड़ दिया बटन पर क्लिक करें और उन्हें सेव करें। "पूर्वावलोकन" का निर्यात सुविधा: क्लिक करें "पूर्वावलोकन"। प्रीसेट बदलें "सीधे डिफ़ॉल्ट" के लिए। सेटिंग बदलेंएस हिसाब से चुना वरीयताओं को और निर्यात करने के लिए पर "एसवीजी / पीडीएफ / पीएनजी" पर क्लिक करें।
Representative Results
चित्रा 1 श्रवण भेदभाव सीखने के बाद माउस मस्तिष्क क्षेत्रों की मात्रात्मक synaptic proteome प्रोफाइलिंग की पूरी कार्यप्रवाह सार। यह एक शटल बॉक्स में पशु प्रशिक्षण के साथ शुरू होता है। उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है, चूहों कुशल सीखने का संकेत, 4 वें प्रशिक्षण सत्र में महत्वपूर्ण एफएम स्वर भेदभाव को दिखाने के लिए शुरू कर दिया। पशु मस्तिष्क क्षेत्र विच्छेदन के लिए चयनित समय बिंदुओं पर बलिदान कर रहे हैं। Synapses के लिए आवश्यक संवर्धन या तो synaptosomes की तैयारी के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है या वैकल्पिक रूप से एक PSD-समृद्ध अंश की तैयारी, दोनों में 3 चित्र में विस्तार से वर्णन किया PSD-संवर्धन विधि कम ऊतक मात्रा के लिए विकसित किया गया है, जैसे 1 – चूहे के मस्तिष्क 12, 18 से 2 hippocampal स्लाइस। यह छोटे ट्यूब, PTFE मूसल इन ट्यूबों के लिए फिटिंग, और मूसल शक्ति के लिए एक प्रयोगशाला ड्रिलिंग ड्राइव की आवश्यकता है। synaptosomes की विशेष प्रोटीन संरचना के कारण, यह दृढ़ता से दो अलग लेकिन पूरक मायनों में नमूना तैयार प्रदर्शन करने की सिफारिश की है। PSDs की scaffolds अक्सर बहुत उच्च आणविक भार उच्च stoichiometry में होने वाली प्रोटीन होते हैं। In-समाधान डाइजेस्ट सबसे अच्छा तरीका उन्हें कुशलता से निकालने के लिए लेकिन उत्पन्न पेप्टाइड मिश्रण का एक oversampling को जन्म दे सकती है। जेल में समानांतर में एक ही नमूने के प्रदर्शन पचाने उन उच्च आणविक भार प्रोटीन बाहर और मध्यम और कम आणविक वजन के साथ प्रोटीन के विश्लेषण के पक्ष में कर सकते हैं। एक व्यापक विश्लेषण के लिए प्रोटिओलिटिक हज़म के दोनों प्रकार की सिफारिश कर रहे हैं। जांच मस्तिष्क क्षेत्रों के ऊतकों के विभिन्न मात्रा में बेहतर तुलना के लिए आवेदन सामग्री का एक समायोजन की आवश्यकता है। चार जांच मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर श्रवण प्रांतस्था आम तौर पर सीमित तथ्य यह हैया। अन्य सभी क्षेत्रों मस्तिष्क की सामग्री को ध्यान से synaptosomes या PSD समृद्ध अंशों की तैयारी के बाद श्रवण प्रांतस्था की राशि के लिए समायोजित किया जाना चाहिए (3.1.1 देखें।)। 50 मिलीग्राम ~;: चूहों से हौसले से तैयार मस्तिष्क क्षेत्रों की विशिष्ट वजन के रूप में निम्नलिखित हैं: श्रवण प्रांतस्था (एसी) हिप्पोकैम्पस (हिप): ~ 90 मिलीग्राम; स्ट्रिएटम (एसटीआर): ~ 120 मिलीग्राम और ललाट प्रांतस्था (एफसी): ~ 100 मिग्रा। PSD-संवर्धन विधि खंड 2.3 में वर्णित लगभग 1500 विभिन्न प्रोटीन और लगभग 250 अलग एक भी जानवर (तालिका 1) के स्तर पर मस्तिष्क क्षेत्र प्रति phospho-पेप्टाइड्स की पहचान के लिए अनुमति दी। प्रोटिओमिक विश्लेषण 24 घंटे पहले प्रशिक्षण सत्र के बाद पता चला है कि पहचान प्रोटीन की 7.3% और phospho-पेप्टाइड्स के 5.8% से पता चला महत्वपूर्ण (पी <0.05) भोले नियंत्रण (तालिका 1) की तुलना में उनके synaptic अभिव्यक्ति में मात्रात्मक परिवर्तन। नीचे नियमों के लिए एक विशिष्ट प्रवृत्तिsynaptic scaffolds के tion FMTD सीखने के प्रारंभिक चरणों के दौरान synaptic वास्तुकला का एक स्पष्ट पुनर्व्यवस्था करने के लिए बात कर सकते हैं। विनियमित प्रोटीन के विशाल बहुमत, एक मस्तिष्क क्षेत्र विशेष ढंग से बदल रहे थे, जबकि केवल 22% दो या अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों में विनियमित किया जाना पाया गया। छह चयनित उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया जाता है। "RhoA संकेतन", "पायदान संकेतन" क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis संकेतन "," axonal मार्गदर्शन संकेतन "," कैल्शियम संकेतन ": आईपीए द्वारा जटिल परिणाम के मेटा-विश्लेषण निम्नलिखित विहित रास्ते की विशेष भागीदारी / हेरफेर के लिए सबूत प्रदान करता है "" उपकला adherens जंक्शनों के पुनर्गठन "," ग्लूटामेट रिसेप्टर संकेतन "," गाबा रिसेप्टर संकेतन "," dopamine रिसेप्टर संकेतन "और" Synaptic दीर्घकालिक potentiation "। <p class="jove_content" fo:keep-together.withइन-पेज = "1"> एकल संवर्धन विश्लेषण प्रोटीन परिवहन, कोशिका आसंजन, फोस्फोराइलेशन, endocytosis, पुटिका की मध्यस्थता परिवहन, अग्रमस्तिष्क विकास और axonogenesis (चित्रा 5) के विषय में ललाट प्रांतस्था में महत्वपूर्ण overrepresented जैविक प्रक्रियाओं का पता चला। श्रवण प्रांतस्था जैविक आयन परिवहन, अनुवाद, mRNA परिवहन, सहित प्रक्रियाओं में प्रोटीन परिवहन और सीखने ध्यान देने योग्य थे। हिप्पोकैम्पस के प्रोटीन अंश का विश्लेषण काफी आयन परिवहन, कोशिका चक्र, अनुवाद, फोस्फोराइलेशन और तंत्रिका तंत्र के विकास से संबंधित समृद्ध प्रक्रियाओं का पता लगाता है। स्ट्रिएटम में, overrepresented mRNA परिवहन, पुटिका की मध्यस्थता परिवहन, axonogenesis, प्रोटियोलिसिस, प्रोटीन परिवहन और endocytosis सहित जैविक प्रक्रियाओं पाए गए। चित्रा 1: व्यवस्थित WorkfloMethodological दृष्टिकोण के डब्ल्यू। यह आंकड़ा रेखाचित्र के मस्तिष्क क्षेत्र विशिष्ट synaptic प्रोटीन संरचना के उच्च संकल्प मात्रात्मक प्रोफाइलिंग की कार्यप्रवाह सार। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2: एफएम टोन भेदभाव के कार्य में चूहों के प्रदर्शन का उदाहरण है। पशु हिट की एक बढ़ती हुई दर (नीला वक्र) और प्रशिक्षण सत्रों के दौरान झूठा अलार्म की एक कम दर (काले वक्र) दिखा। उल्लेखनीय भेदभाव चौथे सत्र से होती है। त्रुटि सलाखों SEM के रूप में प्रदान की जाती हैं। एक Lar देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा की जीईआर संस्करण। चित्रा 3: Synaptosome और PSD-समृद्ध अंश की तैयारी। एक: Synaptosome तैयारी। बी: PSD-समृद्ध अंश तैयारी। दोनों आंकड़े synaptosomes या मस्तिष्क के ऊतकों से वैकल्पिक PSD समृद्ध अंशों की तैयारी की विस्तृत कार्यप्रवाह समझाओ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4: चयनित मात्रात्मक प्रोटिओमिक परिणाम। चुने गए प्रोटीन के रिश्तेदार synaptic प्रचुरता चूहों टीआरए के बीच तुलना कर रहे हैंFMTD काम पर ined (ए वी, एन = 6) और भोले चूहों पर नियंत्रण (NV, एन = 6) 24 घंटे के बाद पहले प्रशिक्षण सत्र। बहुतायत मूल्यों तीन एक प्रोटीन की सबसे तीव्र पेप्टाइड्स के शिखर क्षेत्रों की औसत के रूप में गणना की गई। महत्वपूर्ण बहुतायत परिवर्तन (ए वी / NV; टी परीक्षण) के साथ प्रोटीन भूखंडों के भीतर चिह्नित कर रहे हैं: * पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.005। त्रुटि सलाखों के रूप में एसडी प्रदान की जाती हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 5: GeneCodis / Gephi द्वारा फ्रंटल कॉर्टेक्स के लिए जैविक रास्ते का दृश्य। जीन आंटलजी (जाओ) डेटाबेस (http://geneontology.org) तीन की एक न्यूनतम संख्या के साथ प्रोटीन "जैविक प्रक्रिया" से संबंधित केवल महत्वपूर्ण शर्तों यहाँ दिखाए जाते हैं। नोड्स जाओ शर्तों का प्रतिनिधित्व करते हैं, नोड के आकार, रेखा चौड़ाई और एक निश्चित नोड के कनेक्शन की संख्या प्रोटीन है, जो साझा करने वाले अन्य नोड्स के साथ यह जाने अवधि की संख्या दर्शाती है। Gephi की "सेना एटलस" विधि के कारण, संबंधित नोड्स एक साथ मिलकर क्लस्टरिंग रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। मस्तिष्क क्षेत्र एसी एफसी हिप 000 "चेहरा =" Calibri "आकार =" 3 "> एसटीआर Σ प्रोटीन की पहचान की 1435 1758 1572 1507 6272 विनियमित प्रोटीन (पी <0.05) 59 130 162 108 चेहरे = "Calibri" आकार = "3"> 459 ↑ ए वी / NV 8 4 76 35 123 ↓ ए वी / NV 51 126 86 73 336 पहचान phosphomoti FS 197 361 273 278 1109 विनियमित phosphomotifs (पी <0.05) 8 22 21 14 65 ↑ ए वी / NV 4 00000 "चेहरा =" Calibri "आकार =" 3 "> 17 5 9 35 ↓ ए वी / NV 4 5 16 5 30 तालिका 1: एक प्रोटिओमिक परिणाम का सारांश। इस तालिका में प्रशिक्षित चूहों के एक प्रतिनिधि प्रोटिओमिक प्रयोग का सार (ए वी एन = 6) 24 घंटा उनकी भोले नियंत्रण की तुलना में पहले प्रशिक्षण सत्र के बाद (NV, एन = 6)।459 विनियमित प्रोटीन का योग ओवरलैपिंग नियमों भी शामिल है। 283 विभिन्न नियमों मस्तिष्क विशिष्ट के रूप में निर्धारित किया गया है। विस्तार में, 57 प्रोटीन दो मस्तिष्क क्षेत्रों में विनियमित रहे हैं, 18 प्रोटीन नियमों तीन मस्तिष्क क्षेत्रों में पाया गया और केवल 2 प्रोटीन सभी चार जांच मस्तिष्क क्षेत्रों में विनियमित रहे हैं। त्रुटि tolerances अग्रदूत द्रव्यमान (फूरियर परिवर्तन मास स्पेक्ट्रोमेट्री) 10 पीपीएम टुकड़ा आयन मास (रैखिक आयन जाल) 0.6 दा पेप्टाइड प्रति अधिकतम याद किया चोली 3 फिक्स्ड संशोधनों के लिए जेल में पचा नमूने Cysteine की Carbamidomethylation के लिए में समाधान पचा नमूने MethylthiolatioCysteine के एन चर संशोधनों Methionine के ऑक्सीकरण Asparagin और / या glutamine के Deamidations डेटाबेस Uniprot / Sprot वर्गीकरण माउस सांख्यिकीय पहचान-स्वीकृति सेटिंग्स नए सिरे से औसत स्थानीय विश्वास (ALC) > 50% पेप्टाइड झूठे खोज दर (एफडीआर, ईएसटी पर आधारित है। लूभाव-फ्यूजन) <1% प्रोटीन महत्व (-10logP, संशोधित टी परीक्षण के आधार पर) > 20 अद्वितीय पेप्टाइड्स / प्रोटीन ≥ 1 मात्रा का ठहराव सेटिंग्स: पेप्टाइड्स मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया है, तो: पेप्टाइड महत्व (-10logP) > 30 में पेप्टाइड पहचान नमूनों की ≥ 50% पेप्टाइड संकेत गुणवत्ता > 1 पेप्टाइड औसत क्षेत्र > 1E5 पेप्टाइड अवधारण समय सहिष्णुता <5 4.2.2)।
Discussion
अध्ययन में सीखने और चूहों के मस्तिष्क विभिन्न क्षेत्रों में स्मृति समेकन के दौरान synaptic प्रोटीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का एक सटीक मात्रात्मक रूपरेखा के लिए अनुकूलित एक methodological कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है। सेटअप बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण के लिए नमूना प्रति कम से कम तीन तकनीकी प्रतिकृति के लिए आवश्यक आवेदन के बावजूद एक भी पशु के स्तर पर प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन का अवसर प्रदान करता है।
कार्यप्रणाली खाते में पूर्व और postsynapse उच्च आणविक भार पाड़ प्रोटीन से मिलकर की विशेष प्रोटीन संरचना लेता है, लेकिन असर मध्यम या कम आणविक भार महत्वपूर्ण मध्यस्थ प्रोटीन का भी। synaptosomal तैयारियों के बारे में समाधान हज़म एक कुशल पीढ़ी में परिणाम और, इसलिए, पाड़ व्युत्पन्न पेप्टाइड्स के एक से अधिक प्रतिनिधित्व। यह, बारी में, छोटे या कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन का विश्लेषण दबा सकते हैं। एक से एसडीएस पृष्ठ अंशों का सुझाव दिया तैयारीसमानांतर में एक में जेल पाचन प्रक्रिया के साथ संयुक्त प्रत्येक नमूने की विभाज्य मध्यम और कम बहुतायत प्रोटीन का विश्लेषण की सुविधा और एक अत्यधिक की सिफारिश की पूरक विधि का प्रतिनिधित्व करता है। एक नमूना से निकाली गई सभी भागों का अलग बड़े पैमाने पर spectrometric आवेदन के बाद (जैसे-समाधान को पचाने में जेल पचाने, संयुक्त phospho समृद्ध अंशों) इसी एमएस / एमएस डेटा सेट जोड़ा जा सकता है और आगे प्रोटीन की पहचान और चोटियों से मात्रा का ठहराव के लिए गणना सॉफ्टवेयर या वैकल्पिक लोकप्रिय सॉफ्टवेयर संकुल।
वैकल्पिक रूप से, इन समाधान पचा नमूना के उत्पन्न एक नमूना की जेल में पाचन व्युत्पन्न भिन्न (एक नमूना लेन का अलग से संसाधित जेल क्षेत्रों) और भिन्न के अलग-अलग आवेदन करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी द्वारा जैसे) में वृद्धि कर सकते हैं विश्लेषणात्मक गहराई। हालांकि, इस विस्तारित कार्यप्रवाह नाटकीय रूप से LS-एमएस / एमएस डाटा अधिग्रहण के लिए आवश्यक समय बढ़ जाती है। generatio के लिएसीखने और स्मृति गठन प्रोटिओमिक प्रोफाइलिंग की एक निर्धारित समय के दौरान synaptic प्रोटीन rearrangements की एक विस्तृत आणविक अनुक्रम के एन आवश्यक है। इस बार कोर्स के बाद या यहां तक कि पहले प्रशिक्षण सत्र के दौरान तुरंत शुरू करने और एक बंद-meshed समय सीमा को शामिल किया गया हो सकता जब तक 'जानवरों के प्रदर्शन के बाद लगभग सीखने की अवस्था के asymptotic के स्तर पर पहुंच गया। 8 – प्रशिक्षण के 10 दिनों (विवरण के लिए चित्र 2 देखें)।
synaptic प्रोटीन के फोस्फोराइलेशन परिवर्तन का विश्लेषण FMTD सीखने के दौरान चयनित समय फ्रेम पर एक विशेष ध्यान की आवश्यकता है। एक हाथ cascades संकेत synaptic प्रोटीन प्रोटीन phosphorylations और dephosphorylations से चालू होने के लिए जाना rearrangements की शुरुआत पर पशु प्रशिक्षण का बहुत ही प्रारंभिक अवस्था में होने की संभावना है। दूसरी ओर, वहाँ कई फॉस्फोरिलेटेड synaptic जाना जाता प्रोटीन के लंबे समय तक चलने संशोधनों जो एस भीतर कनेक्टिविटी और विधानसभा को विनियमित रहे हैंynaptic वास्तुकला 19, 20। उन posttranslational संशोधनों भी स्मृति समेकन के बाद के समय बिंदुओं पर उम्मीद कर रहे हैं।
जटिल इस प्रोटिओमिक कार्यप्रवाह द्वारा उत्पन्न डेटासेट bioinformatic संसाधन की आवश्यकता आणविक मार्ग और चाबी के अणुओं के भाग लेने की पहचान। मेटा-विश्लेषण महत्वपूर्ण overrepresented रास्ते, जो सीखने और स्मृति प्रक्रियाओं में एक भूमिका निभा चलता।
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We wish to thank Yvonne Ducho and Kathrin Pohlmann for excellent technical assistance. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) and by the State Saxony-Anhalt / European Regional Development Fund (ERDF) via the Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS).
Materials
| 3M Empore Solid Phase Extraction- Filter | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
| Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
| Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
| Acetic acid | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
| Acetonitrile (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
| Acrylamide (30%) | AppliChem | A0951 | |
| Ammonium hydrogen carbonate | Fluka | 9830 | |
| Ammonium hydroxide | Fluka | 44273 | |
| Ammonium persulfate (APS) | AppliChem | A2941 | |
| Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
| Blue R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
| Bromophenol Blue | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Cantharidin | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
| Centrifuge tubes for MLS-50 | Beckman Coulter | 344057 | |
| Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343776 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
| Eppendorf 5417R centrifuge | VWR | 22636138 | |
| Eppendorf A-8-11 rotor | VWR | 5407000317 | |
| Formic acid | Fluka | 14265 | |
| GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
| Gephi | https://gephi.org/ | ||
| Glycerol | AppliChem | A1123 | |
| Glycine | AppliChem | A1067 | |
| HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
| HEPES Buffer solution | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
| Homogenization vessel 2 mL | Sartorius AG | 854 2252 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Laboratory drilling drive K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
| LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
| LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
| Macs-mix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
| Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
| Methanol | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
| MLS-50 rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
| Optima MAX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
| Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
| PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
| PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
| Plunger/pestle made of PTFE | Sartorius AG | 854 2651 | |
| PotterS homogenizer | Sartorius AG | 853 3024 | |
| Protease Inhibitor complete mini | Roche | 4693159001 | |
| Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
| RapiGest | Waters | 186002122 | |
| Shuttle box | Coulbourne Instruments | ||
| Sodium dodecylsulfate (SDS) | AppliChem | A1112 | |
| Sodium molybdate | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
| Sodium tartrate dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
| SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
| Soundproof chamber | Industrial Acoustics Company | ||
| Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
| Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
| Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
| TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
| Trifluoro acetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
| Ultimate 3000 Ultra HPLC | Dionex/Thermo Scientific | ||
| Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 343776 | |
| Unijet II Refrigerated Aspirator | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
| UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
| Urea | AppliChem | A1049 | |
| Water (high quality purifed) | Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C Pyrogens: < 0.02 EU/ml TOC: < 10 ppb | ||
| Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
| ZipTipC18 Pipette Tips | MILLIPORE | ZTC18S960 |
Referências
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Citar este artigo
Kolodziej, A., Smalla, K., Richter, S., Engler, A., Pielot, R., Dieterich, D. C., Tischmeyer, W., Naumann, M., Kähne, T. High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning. J. Vis. Exp. (118), e54992, doi:10.3791/54992 (2016).