מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר
Summary
Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.
Abstract
Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.
Introduction
מיקרוסקופ פלואורסצנטי כבר זמן רב בשימוש כדי לחקור את ההשפעות של transgenes במערכת העצבים המרכזית דג הזברה, במיוחד והשפעתם על פיתוח 1. מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה אפשרה מיפוי מפורט של התהליכים התאיים מעורבים בהתפתחות מוח, דור שריר, ואירועים התפתחותיות אחרים רבים 2. לימוד מותו של תא יחיד כבר יותר מאתגר, בעיקר בשל הקשיים הטכניים של גרימת מוות של תאים סלקטיבי במהלך הליכי הדמיה סטנדרטיים. עם זאת, שילוב של הדמיה ברזולוצית תא בודד וטכניקות אבלציה ממוקדות במיוחד מאפשר חקירת תגובות הסלולר מיידיות מתח פציעה, כמו גם של אינטראקציות תאי תאים הסוגרות. הבנת התהליכים הללו הוא קריטי, במיוחד עבור מחלות ניווניות כגון מחלת הנוירון המוטורי (MND), שבו אינטראקציות גליה נוירון הוכחו לתרום להתקדמותשל המחלה 3.
MND, או טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), היא מחלה ניוונית של מערכת העצבים הרסנית המשפיעה הנוירונים המוטוריים בגזע המוח, הקורטקס המוטורי, וחוט השדרה. אובדן הנוירונים האלה מוביל לאובדן שריר, וחולה למות תוך 3 – 5 שנים של אבחון 4. הנוירונים המוטוריים בקישור חוט השדרה אל סיבי השריר ויש להם תפקיד חיוני בהנחיית התכווצות שרירים. ניתק בתקשורת זו או מוות של נוירונים אלה בהדרגה מחליש את השרירים ומשפיע על היכולת של החולה לבלוע, ללכת, לדבר, לנשום. לדמיין את מותו של הנוירון מוטורי ואת ההשלכות לטווח קצר חי מספק הזדמנות מצוינת להבין טוב יותר את התהליכים הדינמיים מעורבים הומאוסטזיס ומחלות תא נורמלי.
דג זברה צמחה כמערכת מודל אטרקטיבית כדי לחקור מחלות ניווניות 1. זֶהבשל היתרונות המוצעים על ידי אורגניזם מודל זה, כגון הפריה חוץ, זמן התפתחות קצר, גישה אופטית למערכת העצבים, וקלות transgenesis. בנוסף, את היכולת ליצור מהונדס דג זברת תרכובת בקלות מאפשרת אסטרטגיות תיוג מרובות של תאים מסוגים שונים. אבלציה גנטי מתקרב להרוג סוגי תאים מסוימים לאפשר הפרעה רחבה למדי, אך היא לא יכולה בקרה טובה של מיקוד תאים בודדים 5. טכניקות בסיוע לייזר, מצד שני, לספק שליטה של זמן ומרחב משובח שימשו במשך במודלים של בעלי חיים שונים. בעוד שרוב הגישות להשתמש בציוד מיוחד, כגון לייזרים פעמו 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 או שני פוטונים בחרו קופץ 13, אחרקבוצות מחקר ניצלו לאחרונה של לייזר UV במיקרוסקופים confocal קונבנציונאלי 14.
הטכניקה המתוארת כאן משלב מיקרוסקופיה confocal ברזולוציה גבוהה עם גישה לייזר בתיווך UV לגרום הסלולר מתח או מוות בצורה תלוית-מינון הנוירונים המוטוריים שנבחרו. היא מסתמכת על שימוש ליזר 405 ננומטר מותקן בדרך כלל, כבר נוסה בהצלחה על תרבית תאים ובחיות חיים, מאפשרת אפיון המפורט של אינטראקציות הסלולר, כגון שחרור microglial לאחר מותו העצבי.
Protocol
Representative Results
Discussion
גישות אבלציה לייזר
ליזר בסיוע טכניקות אבלציה לאפשר המיקוד המדויק של קבוצות בודדות או קטנות של תאים. שילוב טכניקה זו עם מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה מניפולציות גנטיות במודלים של בעלי חיים כגון דג זברה מאפשר לחוקרים לבחון את גורלו של תא יחיד שיטתיים ואת האינטראקציות לאחר פציעה.
ה- UV (405 ננומטר) פרוטוקול אבלציה לייזר המתואר כאן מתאר כיצד תאים בודדים ניתן הדגיש או נהרג סלקטיבי (באופן תלוי מינון), בעוד השכנה נוירונים, גליה, ואת האקסונים נותרים ללא פגע. יש לנו מנוצל בהצלחה גישה זו בניסויים בתרביות תאים ולתאר כאן הגישה מפורטת חוט השדרה דג הזברה. אנו מראים יישום של גישה זו בחוט השדרה דג הזברה על ידי הדגשת נוירון יחיד סלקטיבי בתוך רשת של תאים אחרים (איור 5, A ו- <strong> B), או על ידי הריגת נוירון בודד מיד וללא התאוששות (איור 5, C ו- D).
בעבר, מערכות לייזר מתמחה, כגון לייזר פעמו-חנקן או מערכות לייזר שני הפוטונים, נדרשו כדי לגרום נזק לרקמות עצב מוטוריים transections 10, 11, 12, 13. מערכות לייזר אלה נוצלו בהצלחה לגרום נזק לתאים, כגון פקקת עורקים וורידים 6, פציעה 7 כליות חריפה, הלב פציעה 8, וכדי ללמוד גלי סידן ותגובה microglial לאחר פגיעה מוחית 9. יתר על כן, סוסטל ועמיתיו השתמשו ההתקנה confocal קונבנציונאלי (351 ננומטר ו 364 ננומטר לייזרים UV) כדי לגרום נזק אפיתל ותאי גלייה ב תסיסנית 14 </ Sup>.
רלוונטי של מודלי דג זברה עבור הבנת ALS (ומחלות אדם אחרות)
דג הזברה הם אורגניזם מודל בשימוש נרחב, במיוחד ללימודי התפתחותי 28, 29, 30. אמנם יש להם מגבלות מסוימות, את הפוטנציאל שלהם לבנות מודל מחל אנושיות ולתת הבנה של מנגנונים מולקולריים פתוגניים הוא עצום. מודלי דג זברה הוקמו היטב לחקר MND ו הובילו לתובנות מולקולריים חשובים 31, 32, 33, 34. קווי דג הזברה מהונדס יכול להיווצר במהירות (4 – 5 חודשים) ולאפשר מעקב סלקטיבית של תאים מסוג מסוים, תכונות ההופכות אותם תוספת רבת ערך במודלים של בעלי חיים הנוכחי של ALS. עוברי דג זברה / זחלים הם אופטיים שקופים להציע התנסות ייחודיתיתרונות נפשיים המאפשרים הדמיה חי לטווח ארוך ברמה מהתא הבודד במוח או בחוט השדרה, אשר לא ניתן להשיג בקלות במודלים של מכרסמים (או בבני אדם). בשילוב עם שיטות מולקולריות, כגון אבלציה תא בודד, זה מספק פלטפורמת ניסיוני ייחודית לחקר מנגנונים מולקולריים מדויקים in vivo.
הנוירונים המוטוריים ניתן לכוון באופן סלקטיבי באמצעות UV לייזר אבלציה
הנוירונים שדרת דג הזברה מתחילים להתפתח בתוך 10 שעות לאחר הלידה, שהוקמו לאחר כ 48 שעות 35, 36. זו התפתחות מהירה מאפשרת ההדמיה של נוירונים אלה במסגרות זמן קצרות ועם קצב העברת נתונים גבוהים. הנוירונים מוטוריים לספק את הקשר ההכרחי בין המוח ושרירים, ב ALS, מושפעות הקורטקס המוטורי (נוירונים מוטורי עליון), גזע המוח, ואת חוט השדרה (הנוירונים מוטוריים נמוכים). אובדן הנוירונים האלה מוביל בהכרח muניוון וחולשה scle. הנוירונים מוטוריים בחוט של דג זברת השדרה ניתן לזהות על ידי התחזיות המובהקות שלהם ועל ידי השימוש של יזמים ספציפיים הנוירון מוטורי כמו -3MNX1. מיקוד סומה תא של נוירונים מקרין כזה חשף את ניוון האנטרוגרד לאורך הקרנת axonal לאורך זמן (איור 4 ווידאו 1). הדמיה ברזולוציה מתחיל מתא בודד הנוירונים המוטוריים השדרה בנוסף אישר טרנסלוקציה phosphatidylserine ו Annexin V-תיוג הסוגר לאחר אבלציה לייזר (ראה איור 4 משלים וידאו 3 הפניה 27). למרות אנו מדווחים על ההפעלה של Annexin V בלמות נוירונים לאחר גישה אבלציה לייזר UV שלנו, אנחנו לא יכולים להיות בטוחים כי מפל המוות כי היא מופעלת במהלך תהליך מואץ זה תואם בדיוק את ומוות עצבי המתרחשת במהלך ניווניות של מערכת העצבים או הומאוסטזיס תא נורמלי.
בעוד גישה זו אבלציה היא מאוד לשחזורוספציפיות, אסטרטגיות הטבעה שונות עשויות גם להשפיע על היעילות של אבלציה UV. מניסיוננו, זה היה מוצלח ביותר כדי למזער את שכבת agarose אנו מוטבעים הדגים שלנו. שכבות דקיקות של הטבעה בינונית עם שכבה נוספת של מי ביצה עשוי להפחית את כוח UV קבל בסופו של דבר על ידי התא בשל הנחתה ואפקטי פיזור המתרחשים לאורך נתיב קרן.
בעתיד, חציית קווי דג מהונדסים שונים תאפשר ההדמיה של לטווח קצר מיידית (עד 12 שעות) תגובות של תאים נגועים אחרים, כגון גליה, להרס תאים שנגרם ע"י הליזר. לדוגמא, astrocyte ורעילה אוטונומיים בלתי תא בהפרעות ניווניות כגון ALS כבר באור זרקורי המחקר מעורב בכבדות פתוגניות של ALS ספורדי והמשפחתי 37, 38. עם זאת, המנגנונים רעילים גליה סלקטיביותכלפי מנוע נוירונים עדיין אינם ברורים. אנחנו ואחרים נצלו לאחרונה של גישה זו ללמוד לבליעה למות נוירונים ידי המיקרוגליה דמיינו סליקת שרידים עצביים 27, 39, 40.
שילוב הטכניקה אבלציה עם מיקרוסקופיה וסמנים ברזולוציה גבוהה neuroinflammation יאפשר לחוקרים בעתיד להרחיב את ההבנה של תפקוד תא בודד ומערכות תאים מחוברות. אפיון התהליכים האלה בסביבת in vivo הוא קריטי לא רק במסגרות התפתחותיות אלא גם במודלים של מחלות ניווניות, כולל MND, שבו אינטראקציות הסלולר עלולות להיפגע 3, 41.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the MND Research Institute of Australia and the Cure for MND Foundation [GIA 1638], the Snow Foundation, and Macquarie University [MQRDG 9201401462]. Imaging was carried out at the Microscopy Facility in the Department of Biomedical Sciences, Macquarie University. Other members of the MND research center are thanked for their contributions to the development of these methods and fish lines.
Materials
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | Dissolve in egg water with tricaine (0.02%) at 0.8-1.5% | |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| Harvard standard wall Borosilicate with filament Capillary Glass | World Precision Instruments, Inc. | GC100F-10 (short) GC100F-15 (long) |
Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Egg water | 0.6 g Instant Ocean sea salt, 4ml of 1mg/ml methylene blue in 10 l deionized water | ||
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| Pronase | Sigma | 10165921001 | |
| Heat block | Select BioProducts | Digital block heater (SBD110_) | |
| Microinjection apparatus | World Precision Instruments, Inc. | Microinjection was performed by hand under a steromicroscope (Leica) with a loaded glass needle and a Picospritzer II (General Valve corporation) | |
| Stereoscope | Leica | Bright field illumination microscopy was performed on a Leica M165FC stereo dissection microscope (Leica) | |
| Microscope | Leica | SP5 | |
| 35mm glass bottom dish | MatTek Corporation | P35G-0-20-C |
Referências
- Becker, T. S., Rinkwitz, S. Zebrafish as a genomics model for human neurological and polygenic disorders. Dev Neurobiol. 72 (3), 415-428 (2012).
- Wilt, B. A., et al. Advances in light microscopy for neuroscience. Annu Rev Neurosci. 32, 435-506 (2009).
- Philips, T., Robberecht, W. Neuroinflammation in amyotrophic lateral sclerosis: role of glial activation in motor neuron disease. Lancet Neurol. 10 (3), 253-263 (2011).
- Robberecht, W., Philips, T. The changing scene of amyotrophic lateral sclerosis. Nat Rev Neurosci. 14 (4), 248-264 (2013).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
- Jagadeeswaran, P., Paris, R., Rao, P. Laser-induced thrombosis in zebrafish larvae: a novel genetic screening method for thrombosis. Methods Mol Med. 129, 187-195 (2006).
- Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845 (2011).
- Matrone, G., et al. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).
- Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia. Dev Cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).
- Lewis, G. M., Kucenas, S. Motor nerve transection and time-lapse imaging of glial cell behaviors in live zebrafish. J Vis Exp. (76), (2013).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J Neurosci. 32 (11), 3898-3909 (2012).
- Villegas, R., et al. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Dev. 7, 19 (2012).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Soustelle, L., Aigouy, B., Asensio, M. L., Giangrande, A. UV laser mediated cell selective destruction by confocal microscopy. Neural Dev. 3, 11 (2008).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), 1000412 (2010).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).Vol.4th ed. , (2000).
- Clark, K. J., Urban, M. D., Skuster, K. J., Ekker, S. C. Transgenic zebrafish using transposable elements. Methods Cell Biol. 104, 137-149 (2011).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Dev Dyn. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Higashijima, S., Hotta, Y., Okamoto, H. Visualization of cranial motor neurons in live transgenic zebrafish expressing green fluorescent protein under the control of the islet-1 promoter/enhancer. J Neurosci. 20 (1), 206-218 (2000).
- Arkhipova, V., et al. Characterization and regulation of the hb9/mnx1 beta-cell progenitor specific enhancer in zebrafish. Dev Biol. 365 (1), 290-302 (2012).
- Flanagan-Steet, H., Fox, M. A., Meyer, D., Sanes, J. R. Neuromuscular synapses can form in vivo by incorporation of initially aneural postsynaptic specializations. Development. 132 (20), 4471-4481 (2005).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (17), 7092-7097 (2007).
- Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
- Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front. Cell. Neurosci. , (2015).
- Grunwald, D. J., Eisen, J. S. Headwaters of the zebrafish — emergence of a new model vertebrate. Nat Rev Genet. 3 (9), 717-724 (2002).
- Lele, Z., Krone, P. H. The zebrafish as a model system in developmental, toxicological and transgenic research. Biotechnol Adv. 14 (1), 57-72 (1996).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Kabashi, E., et al. Gain and loss of function of ALS-related mutations of TARDBP (TDP-43) cause motor deficits in vivo. Hum Mol Genet. 19 (4), 671-683 (2010).
- Laird, A. S., et al. Progranulin is neurotrophic in vivo and protects against a mutant TDP-43 induced axonopathy. PLoS One. 5 (10), 13368 (2010).
- Lemmens, R., et al. Overexpression of mutant superoxide dismutase 1 causes a motor axonopathy in the zebrafish. Hum Mol Genet. 16 (19), 2359-2365 (2007).
- Ramesh, T., et al. A genetic model of amyotrophic lateral sclerosis in zebrafish displays phenotypic hallmarks of motoneuron disease. Dis Model Mech. 3 (9-10), 652-662 (2010).
- Hanneman, E., Trevarrow, B., Metcalfe, W. K., Kimmel, C. B., Westerfield, M. Segmental pattern of development of the hindbrain and spinal cord of the zebrafish embryo. Development. 103 (1), 49-58 (1988).
- Lewis, K. E., Eisen, J. S. From cells to circuits: development of the zebrafish spinal cord. Prog Neurobiol. 69 (6), 419-449 (2003).
- Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187 (6), 761-772 (2009).
- Philips, T., Rothstein, J. D. Glial cells in amyotrophic lateral sclerosis. Exp Neurol. 262, 111-120 (2014).
- Mazaheri, F., et al. Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia. Nat Commun. 5, 4046 (2014).
- van Ham, T. J., Kokel, D., Peterson, R. T. Apoptotic cells are cleared by directional migration and elmo1- dependent macrophage engulfment. Curr Biol. 22 (9), 830-836 (2012).
- Radford, R. A., et al. The established and emerging roles of astrocytes and microglia in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Front Cell Neurosci. 9, 414 (2015).
