שיתוף לוקליזציה של סמני שושלת תא ואת האיתותים העגבניות
Summary
פיתחנו שני סטים של התחקות ושילובים tdTomato Rosa26 (הביע בכל מקום בגוף בכל התאים) / Cre (לידי ביטוי במיוחד chondrocytes) עכברים: אחד עם 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ואחד עם immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים ממחישים את השינוי הישיר של כונדרוציטים לתוך תאי עצם.
Abstract
מערכת התחקות שושלת התא נעשתה שימוש בעיקר במחקרים בביולוגיה התפתחותית. שימוש recombinase Cre מאפשר ההפעלה של כתב קו תאים ספציפי וכל הצאצאים. הנה, השתמשנו שושלת תא התחקות טכניקה על מנת להוכיח כי chondrocytes ישירות להפוך אוסטאובלסטים ו osteocytes במהלך עצם ארוך ופיתוח condyle mandibular באמצעות שני סוגי Cre, Col10a1-Cre ו Aggrecan-Cre ERT2 (AGG-Cre ERT2), חצה עם Rosa26 tdTomato. שניהם Col10 ו aggrecan הם מוכרים היטב סמנים עבור chondrocytes.
על בסיס זה, פתחנו שיטת שושלת תאים חדשה התחקות בשיתוף עם גורל תא אימונוהיסטוכימיה אל פלורסנט להגדיר על ידי ניתוח הביטוי של סמני תאים ספציפיים. Runx2 (סמן תאים osteogenic בשלב מוקדם) ו הדנטין מטריקס protein1 (DMP1; כסמן תאים osteogenic בשלב מאוחר) היומשמש לזיהוי תאי עצם שמקורם הכונדרוציטים ומצב הבידול שלהם. שילוב זה לא רק מרחיב את תחולת עקיבת שושלת תא, אלא גם מפשט את הדור של עכברים מתחמים. יתרה מכך, מספר, מיקום, וסטטוסי הבידול של צאצאים בתא ההורה מוצגים בו זמנית, מתן מידע רב יותר מאשר שושלת תא התחקות לבד. לסיכום, שיתוף היישום של טכניקות התחקות שושלת תא immunofluorescence הוא כלי רב עצמה על חקירת ביולוגיה של תא in vivo.
Introduction
במהלך הפיתוח, היווצרות העצם endochondral חשבונות עבור יותר מ -80% מנפח השלד. הוא האמין נרחב כי הוא מתחיל עם אפופטוזיס של כונדרוציטים היפרטרופית. בהמשך לכך, התאים ממח העצם הבסיסי לפלוש וליזום אנגיוגנזה, ואחריו בתצהיר עצם חדש על ידי העצם מארו ותאי הנגזרות periosteum 1,2. גורל התא של כונדרוציטים היפרטרופית (HCS), לעומת זאת, כבר בעיה של הוויכוח במשך עשרות שנים 3. בתחילה, HCS נחשב סוף מסלול הבידול הכונדרוציטים, אפופטוזיס נחשב בדרך כלל להיות מה עלה בגורלה של HCS. עכשיו, כמה חוקרים מציעים כי לפחות חלק HCS יכול לשרוד ולתרום היווצרות העצם endochondral. למרות שהציעו שהצמיחה chondrocytes צלחת הייתה היכולת transdifferentiate לתוך אוסטאובלסטים מבוסס על ultrastructure, מכתים immunohistochemical, ו במבחנה מחקרים 46, אף אחת מהשיטות הללו were מכריע הוכחת תרומה הכונדרוציטים אל שושלת אוסטאובלסטים.
שושלת תא טכניקת ההתחקות מספקת דרך קפדנית יותר ללמוד גורל תא. בקצרה מדבר, אנזים recombinase, אשר באה לידי ביטוי רק סוג מסוים של התא, מגרה את הביטוי של הגן הכתב. בדרך זו, זה סוג של תא וצאצאיהם מסומנים 7 לצמיתות. מערכת Cre-loxP היא נפוצה עקיבת שושלת. Cre (אנזים recombinase) יהיה בלו רצף STOP בין שני אתרי loxP ולהפעיל את הכתב בבית (איור 1 א) שורת תאים ספציפית. במקרים מסוימים, החוקר יכול לבחור נקודת זמן מתאימה כדי להפעיל Cre באמצעות תרופה, כגון טמוקסיפן, גרימת Cre איחוי צורה שונה של קולטן אסטרוגן (Cre ERT2) 8. כתבים פלורסנט הפכו לסטנדרט השושלת התחקות ניסויים כי הם להפחית באופן דרמטי את המורכבותולשפר את הדיוק והיעילות של גורל התא התחקות 8,9. tdTomato הופך את הבחירה הטובה ביותר בין כתבי ניאון שכן יש את חלבון פלואורסצנטי מבריקי epifluorescence החזק, מה שהופך אותו בקלות דמיין 7 (איור 1 א).
באמצעות השושלת Rosa26 tdTomato התחקות המערכת, הקבוצה שלנו וחוקרים אחרים הראו כי HCS יכול לשנות הפנוטיפ שלהם לתוך תאי עצם במהלך ההתפתחות 10-14. כדי להשיג זאת, פיתחנו שתי מערכות של התחקות שילובים עם Rosa26 tdTomato (ביטוי בכל מקום בכל התאים) / Cre (ספציפית chondrocytes) עכברים: 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ו immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים מראים כי שתי השיטות דרכים קיימא ללמוד גורל התא in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל מגבלות טכנולוגיות, זה תמיד קשה כדי לחקור את התנהגותם של תאים in vivo. עם זאת, הטכניקה התחקות תא השושלת היא להוכיח להיות כלי רב עוצמה ללימוד ביולוגיה של התא 7-9. במחקר זה, אנו עוד יותר לשפר בפרוטוקול זה על ידי שילוב עם immunofluorescence. בדרך זו, גורל תא יכול להיות מוגד?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
Referências
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
