Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Justus Hermannsd&#246;rfer; Niels de Jonge

doi:10.3791/54943

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Engenharia

El estudio de procesos dinámicos de nano-objetos de tamaño en el líquido de utilizar el escaneado Microscopía Electrónica de Transmisión

Published: February 05, 2017

doi:

10.3791/54943

Justus Hermannsdörfer¹, Niels de Jonge^1,2

¹INM-Leibniz Institute for New Materials, ²Department of Physics,University of Saarland

Summary

Este protocolo describe el funcionamiento de un soporte de la muestra de flujo de líquido para la digitalización de microscopía electrónica de transmisión de AuNPs en agua, tal como se utiliza para la observación de procesos dinámicos a nanoescala.

Abstract

Las muestras totalmente integrados en un líquido pueden ser estudiados a una resolución espacial nanoescala con el escaneado microscopía electrónica de transmisión (STEM) usando una cámara de microfluidos montado en el soporte de muestras para microscopía electrónica de transmisión (TEM) y STEM. El sistema de microfluidos se compone de dos microchips de silicio delgadas ventanas de soporte de membrana de nitruro de silicio (SiN). En este artículo se describen los pasos básicos de la carga de la muestra y adquisición de datos. Lo más importante de todo es asegurarse de que el compartimiento de líquido está montado correctamente, proporcionando así una capa líquida delgada y un sello de vacío. Este protocolo también incluye un número de ensayos necesarios para llevar a cabo durante la carga de la muestra con el fin de asegurar un montaje correcto. Una vez que la muestra se carga en el microscopio electrónico, el espesor de líquido necesita ser medida. Un montaje incorrecto puede dar lugar a un líquido demasiado gruesa, mientras que un líquido demasiado delgada puede indicar la ausencia de líquido, por ejemplo, cuando se forma una burbuja. Finalmente, el protocoloexplica cómo se toman las imágenes y cómo los procesos dinámicos pueden ser estudiados. Una muestra que contiene AuNPs se forma la imagen tanto en agua pura y en solución salina.

Introduction

Escaneo convencional microscopía electrónica de transmisión (STEM) está limitada por la gama de muestras adecuadas para el análisis, específicamente las muestras secas y sólidas adecuadas para la colocación en un alto vacío. Sin embargo, muchas cuestiones científicas y tecnológicas se refieren a materiales y procesos en medio líquido a nanoescala. Las muestras totalmente embebidos en líquido ahora se pueden estudiar con el vástago utilizando un concepto que implica una cámara de microfluidos montado en el soporte de muestras para microscopía electrónica de transmisión (TEM) y STEM ^1. Esta técnica desarrollada recientemente se ha vuelto cada vez más popular, ya que proporciona una nueva visión de los procesos importantes de diversos temas de investigación, incluyendo el crecimiento, la disolución y procesos de agregación de nanopartículas ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^6. No sólo los metales, sino también BIOMInerals ⁷ y los sistemas biológicos pueden ser estudiados ^{^8,} ^{^9,} ^{^10,} ^11. La carga de la muestra y la adquisición de imágenes de STEM en fase líquida es diferente a la de STEM de muestras secas e implican un protocolo que requiere una formación especializada.

El sistema microfluídico se compone de dos microchips de silicio de soporte de nitruro de silicio ventanas (SiN) membrana transparente para el haz de electrones a 200 keV de energía ¹² (véase la Figura 1A). Los detalles de las dimensiones y de la manipulación de estos microchips se pueden encontrar en otros lugares ^{^12,} ^13. La muestra por lo general contiene objetos a nanoescala. En este trabajo se observó nanopartículas de oro (AuNPs). Los AuNPs se inmovilizan en la ventana superior (con respecto a un haz de electrones hacia abajo de viaje) o flotan en el jabón lcarné de identidad. Resolución espacial nanoescala en STEM se obtiene mediante la exploración del haz de electrones sobre los AuNPs y la recolección de electrones dispersados de transmisión utilizando el detector anular campo oscuro (ADF) ^9. Los dos microchips se colocan en una pequeña ranura en la punta del soporte de TEM de flujo de líquido ¹ (el titular opera tanto para STEM y TEM pero se conoce como el soporte TEM). Uno de los microchips contiene un espaciador de modo que se forma un compartimiento de líquido entre los microchips. Juntas tóricas en ambos lados de las dos microchips proporcionan sellado al vacío del compartimiento de líquido ¹³ (véase la Figura 1B).

El objetivo de este artículo es demostrar los pasos básicos de la carga de la muestra y adquisición de datos para que los usuarios interesados pueden acceder fácilmente a esta nueva técnica emergente. Se utiliza un sistema disponible de una compañía específica, pero el protocolo también es válido para los sistemas de otras compañías. La técnica esmás complejo que TEM y STEM convencional, y un número de aspectos prácticos debe ser considerado cuando se trabaja con un sistema de receptáculo de líquido ^13. Lo más importante de todo es asegurarse de que el compartimiento de líquido está montado correctamente, proporcionando así una capa líquida delgada y un sello de vacío. Por lo tanto, es muy importante trabajar de forma limpia y para evitar la formación de polvo durante la preparación y el montaje del soporte de TEM de flujo de líquido. En particular, las juntas tóricas y los dos microchips de silicio necesitan estar libres de toda contaminación. Incluso pequeñas partículas de polvo en uno de los microchips pueden aumentar gravemente el grosor de la celda de ensamblado, que puede impedir la consecución de una resolución espacial útil. Un sello de vacío es importante para que no hay contaminación o daño se dejarán en el microscopio electrónico después del experimento. Este protocolo describe el procedimiento de carga y varios ensayos necesarios. El funcionamiento del microscopio electrónico es sencillo, but requiere algunos pasos adicionales en comparación con la microscopía de muestras sólidas. Con el aumento de espesores líquidos, más electrones son absorbidos y dispersados por el líquido; una medición del espesor de líquido es esencial. Por último, el protocolo explica cómo se toman las imágenes y cómo los procesos dinámicos pueden ser estudiados.

Figura 1: Celda de flujo líquido para Escaneo microscopía electrónica de transmisión (STEM). (A) Ilustración esquemática de la celda de líquido montado. Dos microchips de silicio con nitruro de silicio (SiN) las ventanas de membrana se colocan entre dos juntas tóricas. El líquido está encerrada entre la membrana SiN y por lo tanto se separa del vacío en el microscopio electrónico. A enfocadas exploraciones del haz de electrones sobre la muestra. El contraste se obtiene a partir de electrones dispersados. Las nanopartículas de oro (AuNPs) se inmovilizan dentro del líquido en la membrana SiN, pero también puede moverse en lalíquido. (B) sección transversal esquemática vista lateral de la pila de dos microchips con juntas tóricas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

Figura 2: Procedimiento de limpieza de los microchips de Si. (A) Dos vasos de precipitados se llenan con 40 a 60 ml de acetona y etanol cada uno. Microchips (B) El Si se colocan en el vaso de precipitados lleno de acetona. El lado con la membrana de SiN debe estar hacia arriba. La reflexión de los dos microchips de Si muestra claramente la ranura en la parte trasera de dos microchips. (C) Después de 2 min, los microchips de Si se transfieren al segundo vaso de precipitados lleno con etanol. Después de otro 2 min, los microchips de Si se transfieren a un tejido de sala limpia para el secado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Flujo de líquido Electrónica de Transmisión Microscopy (TEM) Equipo Titular. (A) El titular de TEM flujo de líquido con un tubo de plástico y una jeringa para el flujo de líquido. (B) La punta de la titular de TEM de flujo de líquido retirado del eje del soporte, la tapa del compartimiento de líquido de células, juntas tóricas, y dos microchips de silicio. El tubo sobresale de la parte izquierda de la punta. (C) El compartimento de células de líquido que muestra una junta tórica, la ranura para la colocación del microchip. (D) Los diferentes pinzas en una superficie libre de polvo (papel de aluminio). (E) La tapa del compartimiento de la celda de líquido con sus dos juntas tóricas. (F) Dos microchips de silicio con ventanas de membrana pecado. Izquierda: el microchip muestra sin un espaciador; derecha: el microchip cubierta con un espaciador 200 micras. (G) Un sistema de bomba de microfluidos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figure. 1. Preparación de los microchips 1. Limpieza de los microchips Preparar un espacio de trabajo con un bajo nivel de polvo en una campana de flujo laminar con un filtro de partículas de polvo. Limpiar un portaobjetos de vidrio microscopía de luz con un paño libre de fibra y etanol puro para la colocación y el transporte de los microchips. Colocar el portaobjetos de vidrio en un tejido de sala blanca en una placa de Petri. NOTA: Evitar el uso de etanol técnico en todo momento. Seleccione 5 microchips Base (sin un espaciador) para la colocación de la muestra y 5 microchips con un espaciador 200 nm de espesor. NOTA: Las dimensiones de las ventanas son de 20 x 400 m 2 y el espesor de SiN es de 50 nm. Dado que hay una cierta tolerancia en las dimensiones, se recomienda comprobar las dimensiones utilizando un microscopio de luz. Use pinzas recubiertas de carbono para eliminar los microchips de la caja de almacenamiento y colocarlos en el portaobjetos de vidrio. Coge los microchips con firmeza pero con cuidado en su Mínlados NG. Manejar el microchip tal que el lado de la membrana SiN siempre se enfrenta hacia arriba. Nota: No toque la membrana SiN frágil en el lado superior. También tenga cuidado con el manejo de los microchips para evitar el agrietamiento de sus bordes afilados, que pueden causar problemas debido a partículas de silicio que residen en el microchip o a fugas posteriores. NOTA: El entrenamiento para el procedimiento para eliminar los microchips de la superficie pegajosa se puede realizar en los microchips ficticias (barato). Coloque los microchips en una sala limpia de tejido en una placa de Petri. Cierre el plato y transferirlo a la campana de humos. NOTA: Los pasos que involucran la acetona se llevan a cabo en una campana extractora para la seguridad química. Tomar dos vasos de precipitados de vidrio de 120 ml. Enjuague un vaso de precipitados con acetona y el otro con etanol para limpiarlos. Llenar el primero uno con 40 a 60 ml de acetona y el otro con 40 a 60 ml de etanol. NOTA: Es importante la utilización de líquidos HPLC-grado también para este paso en el protocolo. Transferirlos microchips en el vaso de precipitados con acetona con el fin de quitar el protector resisten capa. Mover suavemente el vaso de precipitados con la mano para enjuagar eficazmente los microchips, pero tenga cuidado de no girar los microchips revés – véase la Figura 2. Después de 2 minutos, retire los microchips y rápidamente transferirlas en el vaso con el etanol. mover suavemente el vaso de precipitados con la mano con etanol durante 2 minutos para eliminar cualquier residuo de la capa protectora. Cubrir el vaso con papel de aluminio y transferirlo a la cabina de flujo laminar. NOTA: No permita que los microchips se secan durante la transferencia para evitar la deposición de desechos. Retire los microchips del vaso de precipitados y colocarlos en un nuevo tejido de sala limpia. Deje secar durante unos minutos y transferir los microchips en el portaobjetos de vidrio de microscopio de luz en la placa de Petri. NOTA: Los microchips húmedos pueden voltear fácilmente alrededor, gire al revés, o se adhieren a las pinzas al ser puesto en libertad. Esto se puede evitar por prescantan los microchips suavemente sobre el papel de filtro y tirando de las pinzas de distancia en la dirección horizontal. Cierre la placa de Petri y la transferencia de los microchips para el filtro de plasma. Colocar el portaobjetos de vidrio con los microchips en el limpiador de plasma. Ejecutar un programa de limpieza 5 min para hacer que la superficie de la membrana hidrófila nitruro de silicio y para eliminar los hidrocarburos. Nota: Los valores adecuados aplicados a nuestro limpiador de plasma son: 70 m Torr, el flujo de gas de 11,5 sccm de O2 y 35,0 sccm de Ar, 50 W Radio Frecuencia (RF) de destino de desvío, 5 W rango de RF, y una longitud máxima de RF reflejadas. Cualquier plasma capaz de inducir una carga superficial es adecuado. Ponga el portaobjetos de vidrio con el microchip de nuevo en la placa de Petri, cierre la tapa, y transferirla al microscopio óptico. Examinar los microchips bajo un microscopio de luz para posibles rupturas de membranas o partículas de suciedad restantes. Tenga especial cuidado con las áreas de la ventana y ver pequeños puntos que indican arupture de la membrana. Descartar los microchips con membranas dañadas. Cierre la placa de Petri y almacenarlo en la cabina de flujo laminar. 2. Preparación de la muestra sobre los microchips Preparar una solución acuosa AuNP (citrato estabiliza) mediante la mezcla de pequeñas cantidades de las soluciones madre que contienen 30 nm de diámetro, AuNPs citrato-estabilizado en una concentración de ~ 3 M. Coloque los microchips en una superficie limpia y pegajosa en una caja de transporte para la deposición de gotitas aplicación / muestra. Coloque una gota (1-2 l) de la solución de la muestra en el lado de la membrana pecado del microchip plasma recién limpiada (utiliza un microchip sin espaciador) y dejar que la solución se seque en la cabina de flujo laminar. NOTA: Este procedimiento se puede repetir con el fin de aumentar la concentración de AuNPs en la membrana SiN. Aplicar 1 l de agua desionizada para el microchip para la eliminación de la sal y / o agentes tensioactivos. Después de 30 s, cuidadosamenteeliminar la gota de agua con papel de filtro. Deje que los microchips se secan en el aire en la cabina de flujo laminar. NOTA: Un número suficientemente grande de AuNPs se han adherido al microchip y no será arrastrado en el agua más. Usa los microchips muestra preparada dentro de las 4 h, como el pecado pierde sus propiedades de superficie hidrófila con el tiempo, lo que puede causar que el líquido se comportan de manera diferente durante un experimento. Nota: Consulte la sección de discusión para más detalles. Utilice una caja de transporte cerrado para el almacenamiento y la transferencia de los microchips. 2. Preparación del titular de Flujo de líquido TEM Limpieza del titular de TEM de flujo de líquido Limpiar todas las herramientas (pinzas y un destornillador) que estarán en contacto con las piezas de vacío utilizando acetona y etanol en un baño ultrasónico y colocarlos sobre la superficie libre de polvo proporcionado por un trozo de papel de aluminio nueva, en el banco de trabajo. Trabaja con guantespara evitar la contaminación del soporte de TEM de flujo de líquido. NOTA: Las herramientas no tienen que ser limpiados exhaustivamente si uno está seguro de que estén limpios para el trabajo con piezas de vacío. Los guantes pueden ser evitados si uno es capaz de manejar el equipo sin tocar las piezas de vacío. Coloque el soporte TEM flujo de líquido bajo el microscopio óptico binocular de tal manera que la punta del soporte que contiene la cámara de líquido se puede observar. Vea la Figura 3. Retire la tapa de la punta del soporte y colocarlo sobre la superficie libre de polvo. NOTA: La tapa de titanio es sensible a los arañazos provocados por materiales más duros como las pinzas. Se recomienda utilizar pinzas recubiertos de polímero para los materiales sensibles. Preparar al menos 1 a 2 ml de agua pura (grado HPLC). NOTA: Si no se utilizan líquidos de grado HPLC, entonces se recomienda comprobar que los líquidos utilizados no contienen micro partículas que podrían conducir a obstrucciones del sistema de flujo; filter el líquido según sea necesario con un filtro de micro-poros. Usar una jeringa de vidrio (1 ml) para eliminar todo el sistema de flujo con 0,5 ml de agua pura. Se recomienda utilizar un sistema de bomba de jeringa de microfluidos. Utilizar una pipeta y / o papel de filtro para eliminar el líquido de ser expulsado en el compartimiento de células líquido. Probar todos los tubos para el flujo de líquido. Secar la punta titular después utilizando papel de filtro y / o una pipeta. Utilizar el microscopio óptico para comprobar que la punta del soporte esté limpio y seco. Si es necesario, lavar la punta del soporte con agua o etanol para eliminar los residuos sólidos que podrían haber sido dejados atrás por la solución seca. Retire los trozos de polvo o restos de fibras así. Retirar con cuidado estas piezas con pinzas, evitando así arañar la superficie de titanio. También puedes ver el interior de las ranuras de junta tórica y retirar los restos de líquido con una pequeña muestra de tejido para salas blancas. NOTA: Si el titular no se convierte en limpio con este procedimiento, entonces se recomiendapara quitar la punta del soporte y limpiarlo en acetona durante 2 min y en etanol durante 2 minutos usando un baño ultrasónico. Inspeccione todas las partes adicionales de la punta (juntas tóricas, la tapa y tornillos) bajo el microscopio de luz y eliminar el polvo, fibras, etc … NOTA: En ocasiones, pequeñas piezas procedentes de los tornillos o los microchips de Si ha de ser eliminados. Si es necesario, limpiar brevemente las partes de vacío con etanol de grado HPLC. La tapa y los tornillos se pueden limpiar con ultrasonido, tal como se explica por la punta. Evite colocar las juntas tóricas con frecuencia en etanol, ya que puede hacer que las juntas tóricas quebradizos con el tiempo, disminuyendo su estanqueidad al vacío. El sistema es operado sin grasa de vacío, pero si se producen problemas de sellado, grasa de vacío se puede utilizar. Vuelva a colocar las juntas tóricas en las respectivas ranuras del soporte y comprobar que se ajustan y no sobresalen en cualquier lado de la ranura. Mantenga el titular de TEM flujo de líquido libre de polvo hasta que la carga de muestra (por ejemplo,., Cubriéndola con papel de aluminio). Montaje del titular de TEM de flujo de líquido NOTA: El siguiente procedimiento describe el procedimiento de carga de microchips en un soporte de la muestra con la orientación óptima para STEM. En esta configuración, el microchip base con la muestra será el microchip superior una vez transferido en el microscopio. Vea la Figura 4. Para TEM, se obtiene una resolución espacial más alta en la parte inferior de la celda de líquido con respecto a un haz de electrones hacia abajo de viaje. Por lo tanto, los microchips se pueden montar al revés. Use unas pinzas curvas para agarrar el microchip muestra en el lado largo y colocarlo dentro de la ranura (cajera) en la punta del soporte TEM flujo de líquido. Mantenga el lado de SiN hacia arriba. Comprobar la correcta colocación del microchip en la ranura utilizando un microscopio óptico binocular. NOTA: Si la junta tórica debajo de la microchip no está colocado correctamente, el microchip puede sobresalir fesde la ranura. Colocar una gota de 0,3 l de líquido filtrado para el experimento en el microchip muestra usando una micropipeta. Si es necesario, corregir el microchip en su lugar con pinzas, ya que las fuerzas capilares de la gota pueden tirar del microchip fuera de su bolsillo. Use pinzas revés curvados para tomar el segundo microchip (el que tiene la capa de separación). Con cuidado, gira el microchip al revés. Coloque el espaciador microchip en el microchip de base en la ranura. Nota: Este procedimiento necesita ser hecho con la suficiente rapidez para evitar el secado de la gotita en el microchip de la muestra. Inspeccionar la colocación correcta con ayuda de un microscopio binocular de luz mientras se mueve una pieza de material reflectante de la luz por debajo de la punta del soporte de la muestra. Ambos microchips deben estar alineados exactamente paralelo para lograr la mejor superposición de las ventanas de SiN. NOTA: En caso de que las ventanas no se superponen, los microchips se puede reposicionar empujando a un lado con una punta delas pinzas, pero evitar mover los microchips demasiado, ya que la membrana de SiN puede dañarse fácilmente. Algunos microchips vienen con una configuración cruzada (la ventana de un microchip es perpendicular a la ventana en el otro microchip); Esta configuración facilita la alineación de los dos microchips todavía también reduce el campo de visión en el microscopio electrónico. Tome la parte frontal de la tapa de la cámara de muestras con las pinzas y la coloque boca abajo. Sin tocar los microchips, coloque la parte posterior de la tapa en la punta. Lentamente abrir las pinzas de tal manera que la tapa se basa únicamente en la rama inferior de las pinzas. baje lentamente la tapa hasta que descanse sobre los dos microchips. Retire las pinzas. Vuelva a comprobar la alineación de las ventanas de ambos microchips. Si es necesario, retire la tapa, ajuste la posición de los microchips, y coloque la tapa de nuevo. Coloque los tornillos y fijarlos en sus lugares habituales. Compruebe la alineación de las dos ventanas. yof es necesario, retire los tornillos de nuevo y ajustar los microchips. NOTA: No fijar los tornillos en exceso, ya que esto puede causar daños. Un sello de vacío se logra cuando los tornillos lo aprietan. Compruebe el sellado mediante el inicio de un flujo de líquido a través del sistema usando una velocidad de flujo de 4 l / min. Si no se observa fugas a cada lado de la punta, esto es una buena indicación de la estanqueidad de vacío. Transferir el titular de la estación de bombeo de vacío y verificar la estanqueidad de vacío. El nivel de vacío debe alcanzar al menos 10 -5 mbar a 5 min de bombeo. NOTA: Se recomienda probar la estación de bombeo con un soporte simulado antes de su uso. Transferir el soporte al microscopio electrónico en su recinto para evitar que se acumule el polvo. NOTA: Cada titular comercial viene con un recinto. 3. STEM de una muestra de líquido Ajuste del microscopio electrónico para STEM </strong> NOTA: La operación del microscopio electrónico se describe en este protocolo se basa en procedimientos estándar que se pueden encontrar en el manual de usuario. El protocolo describe el detalle requerido más allá de los procedimientos estándar para la adquisición de datos en muestras líquidas. Iniciar el microscopio con el modo STEM alineados. En el soporte de la muestra, insertar una muestra de prueba que consiste en una película fina de carbono con AuNPs. Ajustar la configuración del microscopio STEM de la siguiente manera: establecer la corriente de la sonda a 0,18 nA y la convergencia semi-ángulo del haz de electrones a 20 mrad mediante la selección de un tamaño de punto de 4C y la apertura del objetivo de 30 micras. Seleccione una longitud cámara de 8 cm. Tome nota de la densidad de corriente se indica medido en la pantalla de fluorescencia, mientras que se inserta el detector de ADF. Retire el soporte de la muestra. NOTA: Este valor es necesario actual más adelante para estimar el espesor del líquido. Iniciar el flujo de líquido con agua pura. No exceda de un flujo de 2l / min. Insertar el soporte TEM de flujo de líquido en el microscopio electrónico y comenzar la evacuación. Compruebe tanto la indicación de vacío de la cámara de vacío previo y la duración de la evacuación. Si el nivel de vacío es estándar y la duración del procedimiento de bombeo no excede el tiempo de evacuación normal (de alrededor de 1 min) en un factor de dos, insertar el soporte. Abrir la válvula de haz cuando el vacío de la cámara principal de la muestra está en el intervalo que permite su apertura. Inserte el detector de ADF presionando el botón ADF. NOTA: Este protocolo se refiere a un detector ADF situado por encima de la pantalla de fósforo del microscopio electrónico. Ajuste el microscopio en el modo de adquisición de imagen continua utilizando un tamaño de imagen de 512 x 512 píxeles, un tiempo de permanencia de píxel de 2 mu s, y un aumento de 20.000. Buscar la ventana de SiN mediante la traducción de la etapa en las direcciones x e y. NOTA: Los microchips bloquear cualquier electrones que pasan a través de la muestra hacia la detección deo; señal sólo es visible en el lugar del pecado. Ver Figura 5. A veces, es más fácil de encontrar la ventana de SiN mediante la visualización de la pantalla fluorescente. Una vez que se ha encontrado la ventana, ajustar la configuración de contraste y brillo (usando los respectivos mandos) para que el borde de la ventana se hace visible. Mueva el borde hacia el centro del campo de visión pulsando los botones X e Y de traducción de la platina. Pulse el botón de reinicio de la lente objetivo. NOTA: El brillo se debe reducir en gran medida en comparación con una muestra de vacío a causa de una fuerte dispersión en el líquido. Proceder al centrarse grueso de la esquina afilada en el borde de la ventana de SiN mediante el ajuste de la posición vertical (z-traducción) de la platina. Compruebe que la posición de la muestra está a la altura eucéntrica girando el escenario por 5 ° y girando de nuevo. Características de la muestra y la esquina de la ventana de SiN no deben desplazar a bajos aumentos. <br/> NOTA: Cierre la válvula de haz si no opera el microscopio, ya que la exploración en la misma posición durante un tiempo más prolongado puede provocar daños de la muestra y la formación de burbujas Volver a ajustar la posición vertical, según sea necesario para colocar el borde de la ventana en el medio del área de visualización de nuevo. Almacenar la posición de la etapa con el botón de tienda de software. Pasar a una posición en la que pequeños trozos de escombros u otros objetos de alto contraste (por ejemplo, AuNPs) están presentes mediante la traducción de la etapa en las direcciones x e y. Ajuste el enfoque de la lente objetivo de modo que todos los objetos aparecen agudo en el enfoque. Tome nota de la densidad de corriente medida en la pantalla de fósforo visible a través del software de funcionamiento, lo que indica la corriente transmitida a través del retenedor de líquido y a través de la abertura del detector de ADF. Calcular el espesor de la celda líquida utilizando la Ecuación 1. Proceder sólo si el espesor de líquido ha sido determinada y no exceder de 3 micras. <br /> NOTA: El espesor de la celda de líquido se puede determinar por la relación de la densidad de corriente medida con y sin la muestra usando la siguiente ecuación 14 Ecuación 1 con t SiN el espesor de la membrana de nitruro de silicio amorfo y t agua el espesor de la capa de agua. El camino libre medio longitudes cantidad de SiN l = 0,79 micras de SiN, y = l de agua = 3,0 micras de agua para el detector de apertura semi-ángulo de 35 mrad 14. Observe cuidadosamente el líquido a aumentos menores para asegurar que las burbujas de gas no están presentes. Las burbujas de gas se pueden prevenir mediante el uso de flujo de líquido continua y la sonda de corriente inferior a 0. 5 nA. Traducir el escenario en las direcciones x e y hasta un área que contiene al menos 20 hectáreas AuNPss se encontraron resultados. Ajuste el tamaño de la imagen de 1.024 x 1.024 píxeles, el tiempo de permanencia de píxeles a 19 mu s, y la ampliación a 400.000. Adquirir imágenes de AuNPs adheridas a la membrana de SiN pulsando el botón de adquisición. NOTA: Una vez que se han obtenido imágenes en las que los AuNPs son visibles con un fuerte contraste y los bordes afilados (véase la Figura 6), uno puede estar seguro de que el experimento está correctamente configurado. En caso de que se produzcan problemas inesperados, no continúe con el experimento, pero asegúrese de resolver la causa. Madre de la disolución de AuNPs Retire el soporte TEM flujo de líquido desde el microscopio y detener el flujo de líquido. Preparar al menos 1 ml de una solución de 0,1 M de cloruro de sodio en agua de calidad de HPLC en una jeringa de vidrio. Ajustar el sistema de flujo a una velocidad de 20 l / min y enjuagar todo el sistema de flujo con 0,3 ml de la solución salina. El uso de papel de filtro para recoger el líquido de ser expulsado en elotro extremo de la tubería. A continuación, vuelva a ajustar el sistema de flujo de 2 l / min. Comprobar la integridad de la ventana de SiN con un microscopio óptico binocular. Si no se observa fugas, vuelva a insertar el soporte de TEM de flujo de líquido en el microscopio. Compruebe la indicación de vacío de la cámara de pre-vacío y la duración de la evacuación. Si el nivel de vacío es estándar y la duración del procedimiento de bombeo no excede el tiempo de evacuación normal (de alrededor de 1 min) en un factor de dos, inserte el soporte Mueva la parte posterior platina del microscopio de nuevo a su posición anterior utilizando la posición de fase almacenado. Ajuste el microscopio en el modo de adquisición de imagen continua utilizando un tamaño de imagen de 512 x 512 píxeles, un tiempo de permanencia de píxel de 2 mu s, y un aumento de 20.000X. Ajustar el contraste, el brillo, el enfoque y la altura eucéntrica, tal como se describe en los pasos 3.1.7-3.1.9. Encontrar un lugar de interés mediante la traducción de la etapa en las direcciones x e y. Ajuste el tamaño de la imagen1.024 x 1.024 píxeles, el tiempo de permanencia de píxeles a 2 microsiemens, y la ampliación a 500.000. Grabar una serie de imágenes de STEM manualmente pulsando el botón de adquisición una vez que la imagen anterior ha sido registrado. NOTA: Las AuNPs comienzan a disolverse tan pronto como el haz de electrones se escanea sobre la muestra. Las partículas fuera del área irradiada no se ven afectados y pueden ser observados inmediatamente después. El sello de tiempo se almacena en el encabezado de la imagen. También es posible usar software para la recolección automatizada de una serie de imágenes en una película. Desmontar y limpiar el soporte TEM después del experimento Cuando los experimentos TEM en fase líquida se han completado y el soporte se retira del microscopio electrónico, limpiar la tubería, la cámara de líquido, y sus componentes con el fin de eliminar las partículas sólidas o resto de la sal que podrían influir en futuros experimentos. Afloje un poco el tornillo trasero de modo que aún es fijoen su ranura pero la tapa se puede quitar fácilmente. Aflojar el tornillo delantero, retirarlo y colocarlo en un ambiente libre de polvo. Retire la tapa y colocarla en ambiente libre de polvo para su almacenamiento. Retire los dos microchips del bolsillo. Separarlos por inmersión con cuidado en agua o en la solución restante del experimento. Coloque los microchips en un pañuelo de papel con el lado de la membrana de SiN hacia arriba y dejarlos secar al aire para su posterior análisis. Retire las juntas tóricas y limpiar las ranuras respectivas con agua grado HPLC. Almacenar las juntas tóricas en un ambiente libre de polvo. Usar una jeringa de vidrio (5 ml) para eliminar todos los tubos (entrada y salida), cada uno con 5 ml de agua de grado HPLC. Recoger el líquido con un pequeño vaso de precipitados se coloca debajo de la punta titular de TEM. Después de lavado, usar una pipeta y / o filtro de papel para eliminar el líquido restante en el compartimiento de líquido. Inspeccionar la punta del soporte TEM y eliminar los residuos como los bordes rotos de la micro siliciovirutas, fibras o polvo. Si la sal es aún visible, repita el procedimiento de limpieza. Devolver las juntas tóricas de sus ranuras. Almacenar el titular de TEM y sus componentes en un entorno libre de polvo. Procedimiento alternativo a 3,2: STEM de mover las nanopartículas de oro NOTA: Se requiere un procedimiento de montaje diferente para estudiar el movimiento de AuNPs en líquido. Omita el paso 1.2. Cargar las AuNPs en el microchip de silicio inmediatamente antes de insertarlos en el soporte TEM en el paso 2.2. Mantenga la muestra cubierta por una capa de líquido en todo momento con el fin de evitar una fuerte unión de las AuNPs a la membrana SiN. Los otros pasos del protocolo son los mismos. Se obtiene una serie de imágenes de STEM en el paso 3.2.6. Figura 4: Montaje del receptáculo de líquido de flujo TEM. (A) El compartimento celular líquido con THe más pequeña junta tórica colocada en la ranura. El recuadro muestra la vista superior. (B) El microchip de base se coloca en la toma de corriente correspondiente. El recuadro muestra la vista lateral en ángulo tal que el microchip es visible desde el reflejo de luz. (CD) se añade una gota de la solución al microchip. (EG) La colocación del microchip cubierta. (HI) Colocación de la tapa del compartimiento de la celda líquida. (J) La fijación de la tapa con los dos tornillos. (K) Montado titular de TEM flujo de líquido. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Posicionamiento inicial y el enfoque mediante micrografías de STEM. (A) Para localizar la ventana de SiN, la etapa se desplaza hacia el sig más brillantenal. El microchip de silicio es lo suficientemente delgada para algunos electrones que pasan a través de cerca de la ventana. (B) El borde de la ventana de SiN centrado mostrando algunos AuNPs que aparecen brillantes en la ventana de membrana de nitruro oscura (menos dispersión). El borde del microchip es brillante debido a la dispersión excesiva. (C) El enfoque se realiza en la esquina de la ventana de SiN. Las imágenes muestran bajo-se centró, en el foco, y las situaciones de sobre-enfocado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

El titular de TEM flujo de líquido se utilizó para estudiar el comportamiento de AuNPs en líquido. AuNPs se inmovilizaron de forma estable en la membrana de SiN en agua pura y se obtuvieron imágenes con una resolución nanoescala utilizando STEM en fase líquida (Figura 6). se obtuvo un contraste excelente en el oro fuertemente de dispersión. La densidad de corriente en la pantalla de fósforo medido para una muestra de ensayo en seco era de 20 pA / cm², mientras que fue de 8 pA / cm² con el titular de TEM flujo de líquido que se inserta. Utilizando la ecuación 1, T agua = 2,4 ± 0,5 micras, mucho más grande que lo que se esperaba en función del espesor del espaciador 200 nm. Sin embargo, el espesor no es demasiado grande para la formación de imágenes de los AuNPs con resolución espacial nanométrica. El espesor líquido era más gruesa que la de 200 nm establecido por el separador debido a la abultada de las membranas pecado, no planitud de los microchips, y los residuos que residen en los microchips. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Para el agua pura, las AuNPs mantener su forma durante la proyección de imagen 16, aunque los productos de radiólisis reactivos (e – AQ, H •, H +, OH •) procedentes de la interacción del haz de electrones con agua puede oxidar átomos de oro individuales, que conduce a un cambio de forma de la AuNPs 15. Sin embargo, cuando se utilizó el sistema de flujo de líquido para introducir iones cloruro en un segundo experimento, la estabilidad de los AuNPs cambió. Los iones cloruro son capaces de estabilizar átomos de oro oxidado en forma de tetrachloroaureat, AuCl 4 -. La Figura 7 muestra que los AuNPs disueltos lentamente durante una serie de lapso de tiempo de formación de imágenes de STEM, similar a los resultados reportados anteriormente 16. Para la tasa de dosis de electrones usados, se llevó a ~ 300 s para disolver los 30 AuNPs nm de tamaño. Los movimientos de AuNPs en finales r se estudiaron en un tercer experimento (Figura 8). Antes del experimento, el titular de TEM flujo de líquido se limpió con el fin de eliminar los restos de sal. A diferencia del primer experimento, se utilizó un enfoque de preparación de la muestra alternativa para lograr una unión más débil de las AuNPs a la membrana SiN 14. En este experimento, la solución AuNP se colocó en el microchip de silicio y montado en el soporte de TEM de flujo de líquido sin dejar que la solución se seque. De esta manera, los AuNPs fácilmente separados de la membrana SiN sobre formación de imágenes en la tasa de dosis utilizado. Algunos de los AuNPs movido fuera del campo de vista en las soluciones a granel, mientras que los restantes AuNPs permanecieron dentro del campo de visión en las proximidades de la ventana de SiN. No se observaron movimientos de estos AuNPs, y finalmente se aglomeran. Después de un tiempo, estos aglomerados también se separan de la membrana de SiN y movidos fuera del campo de visión y en la solución. ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 6: Escaneo microscopía electrónica de transmisión (STEM) Micrografía de AuNPs 30 nm de diámetro en la parte superior de una capa de agua pura. La imagen que se muestra es un área seleccionada de la imagen original. El tamaño de la imagen era 1.024 x 1.024 píxeles, el tiempo de permanencia fue de 19 píxeles mu s, el tamaño de píxel era 0,73 nm, y el aumento fue 400,000X. La dosis de electrones era por lo tanto 7,1 x 10 4 e – / nm². La densidad de corriente medida en la pantalla de fósforo fue de 8 pA / cm 2, por lo que el espesor de líquido se calculó a ascender a 2,4 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Serie de lapso de tiempoMicrografías de tallo de AuNPs en solución salina. (AD) Imágenes extraídas de la serie de lapso de tiempo de las imágenes de STEM en intervalos de 30 segundos. Los AuNPs disuelven gradualmente en el líquido como consecuencia de la presencia de iones cloruro. El tiempo de permanencia del pixel fue de 2 mu s, el tiempo de trama de la serie lapso de tiempo fue de 1,75 s, el tamaño del pixel fue de 0,44 nm, y la ampliación fue 500,000X. La dosis de electrones por imagen fue de 1,2 x 10 4 e – / nm². El espesor de líquido era 2,4 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: STEM Micrografía de AuNPs moviéndose en el agua pura. (A) de la membrana de SiN con AuNPs, varios de los cuales se seleccionan con flechas. (B) pistas de movimientoAuNPs de los seleccionados (véase A). Algunos AuNPs se alejan del campo de visión durante el tiempo de formación de imágenes. Las AuNPs restantes se desplazan lateralmente a lo largo de la membrana de SiN y comenzar a aglomerar. Tras alcanzar un tamaño crítico clúster, despachan desde la membrana y se alejan del campo de la view.The tiempo de permanencia fue de píxeles a 1 microsegundo, el marco de tiempo fue 0,52 s, el tamaño del pixel fue de 1,8 nm, y la ampliación fue 120,000X. La dosis de electrones por imagen era de 3,5 x 10 2 E – / nm² y el espesor de líquido fue de 2,4 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El protocolo descrito permite STEM de AuNPs en un líquido, incluyendo la observación de procesos dinámicos. El montaje del soporte es una técnica fácil de aprender. Sin embargo, varios aspectos deben ser considerados cuando se trabaja con el titular de TEM flujo de líquido. Por ejemplo, los bordes rotos del microchip Si o partículas grandes en las juntas tóricas pueden dar lugar a fugas de la celda de líquido. Por otra parte, las partículas grandes (> 200 nm, por ejemplo, polvo o suciedad Si) en la membrana SiN puede resultar en un aumento del grosor de la celda de líquido, que conduce a un bajo contraste de formación de imágenes o para una resolución espacial baja y puede incluso causar SiN ventanas se rompan. Es importante destacar que los residuos de sal u otros productos químicos pueden influir en el resultado de los experimentos de un modo no deseado. Por lo tanto, es crucial que las diferentes etapas de preparación de la muestra y el conjunto de soporte se llevan a cabo con cuidado y en un entorno limpio y libre de polvo.

El espesor de la ce líquidoll determina la resolución alcanzable, así como el contraste de las imágenes obtenidas ^17. Este espesor se puede ajustar a través de espaciadores situados en una de las dos microchips Si. Dependiendo de las dimensiones de la muestra, diferentes espesores de la célula de líquido se pueden realizar. Para el estudio de AuNPs, es posible utilizar espaciadores pequeños (200-500 nm), mientras que las células eucariotas enteros necesitan grandes espaciadores de hasta 5 m. El espesor de la celda de líquido está influenciada además por el abultamiento de las ventanas de membrana SiN resultantes de la diferencia de presión entre la célula de líquido y el vacío circundante. Este efecto es más pronunciado con grandes ventanas de membrana pecado. Por lo tanto, con el fin de minimizar el espesor de la celda de líquido, se recomienda el uso de pequeñas ventanas de membrana SiN. En caso de que es difícil encontrar una superposición entre dos pequeñas ventanas, que se puede montar en una configuración cruzada usando un microchip de base diferente. configuraciones alternativas largEly prevenir el vientre y se componen de un microchip ¹⁸ o membrana monolítica ventanas sostenidos por pilares ^19, pero esos inconvenientes presentan con respecto a la carga de muestras. Uno de los aspectos más desafiantes de la tecnología actual es la falta de un control preciso sobre el espesor líquido. A menudo, el líquido es mucho más gruesa que lo que se espera de las dimensiones separadores utilizados, como se muestra aquí. Varios grupos utilizan cámaras cerradas líquido ^{^4,} ^{^20,} ^{^21,} ^22; estos sistemas tienen algunas ventajas con respecto a la resolución espacial, como el espesor de líquido se puede reducir mediante la inducción de una burbuja en el líquido. Alternativamente, las ventanas SiN pueden ser obligados a colapsar, lo que lleva a una capa de líquido delgada. En tercer lugar, existe el recinto de otras ventanas más delgadas (por ejemplo, el grafeno) ^23, también resulta en líquidos mucho más delgadosde lo que es posible con el sistema descrito en este protocolo. Sin embargo, es imposible de flujo de líquido en dichos sistemas.

En cuanto a cualquier técnica de microscopía de alta resolución, debe tenerse en cuenta una serie de aspectos experimentales. El aspecto más importante es la interacción del haz de electrones con el líquido o la muestra. Además de los daños por radiación, lo que limita la resolución espacial alcanzable para muchos muestras sólidas ^24, las muestras líquidas también están influenciadas por los productos de radiólisis generado haz de electrones ^{^15,} ^25. Dado que estos productos pueden influir en el experimento, la interpretación de datos cuidadosos y diseño experimental son esenciales ^26. Los ajustes del microscopio debe ser elegido de acuerdo a los objetivos de un estudio en particular. STEM ADF es más potente para las nanopartículas de imagen de un alto número atómico (Z) con espesores mayores de la célula líquida, WHILe TEM da un mejor contraste en materiales de bajo Z y suele ser más rápido, pero requiere más delgadas capas líquidas ^3. En lugar de utilizar el detector de ADF, la (BF) detector de campo brillante se utiliza a veces para la imagen de la célula de líquido, ya que STEM BF es ventajoso para formar imágenes de materiales de bajo Z en capas gruesas ^27. Con el aumento de espesor de la célula de líquido, se necesita más actual. Sin embargo, esto también aumenta las concentraciones de los productos de radiólisis y aumenta el daño por radiación. También hay que señalar que una inversión de contraste se observó en el detector ADF para líquidos muy gruesas (> 10 m para el agua).

Las condiciones de líquidos se cambiaron entre nuestros experimentos mediante la eliminación del soporte del microscopio y el intercambio de la muestra y el líquido. Además de cambiar la concentración de sal, es fácilmente posible cambiar otras propiedades del líquido que fluye en por diferentes líquidos (por ejemplo, uno puedeusar soluciones tampón con el fin de establecer un pH específico ¹⁶ o puede introducir soluciones orgánicas u otros aditivos). También es posible cambiar el líquido mientras el soporte todavía está insertada en el microscopio por el flujo de líquidos a través del sistema de microfluidos. Sin embargo, en este caso, se desconoce momento en el que punto el líquido a los cambios de la muestra. También es digno de mención que los microchips de apoyo electrodos están disponibles, por lo que los experimentos de la electroquímica a nanoescala pueden llevarse a cabo ^28.

Los objetos de estudio no se limitan a AuNPs en agua, pero una amplia variedad de muestras se pueden estudiar usando el protocolo descrito anteriormente, incluyendo sílice, óxido de titanio, y polímeros. Si los movimientos de los objetos son demasiado rápidos para capturar en una imagen dentro de la adquisición, la viscosidad se puede reducir en un orden de magnitud mediante el uso de una mezcla de 50% de glicerol y 50% de agua.

A partir de los puntos antes mencionados,una serie de ventajas, posibilidades, y también desventajas se hacen evidentes. Cuando se trabaja con STEM-fase líquida, las desventajas más importantes a considerar son que: 1) cualquier experimento está influenciada por la interacción dinámica del haz de electrones con la muestra completa (el objeto bajo observación, el líquido y las membranas SIN); 2) manipulación de la muestra es tedioso, y a menudo es difícil lograr una capa de líquido delgada porque la muestra o los microchips contienen algunas partículas de tamaño micrométrico; 3) el espesor de líquido por lo general difiere en gran medida del espesor previsto establecido por el espaciador; y 4) de resolución espacial y de contraste dependen en gran medida del espesor de líquido y la diferencia entre la densidad de cambio del objeto bajo observación y el líquido.

En la actualidad, existen amplios métodos para la microscopía de objetos en un líquido con una resolución espacial nanométrica. La microscopía electrónica de hielo amorfo es una poderosa técnica ^29,pero los procedimientos experimentales implicadas son delicadas, no todos los experimentos permiten la preparación de la muestra en hielo, y los experimentos con resolución temporal son imposibles. La microscopía ³⁰ de rayos ^X, ³¹ en principio, podría ser utilizado, pero tiene una resolución espacial limitada y no está ampliamente disponible en los laboratorios. Microscopía de fuerza atómica en líquido ha sido establecido, pero es una técnica única superficie de ^{^32,} ^{^33,} ^{^34,} ^35. La microscopía óptica no presenta la suficiente resolución espacial. En la actualidad, la microscopía electrónica en el líquido parece ser la técnica más poderosa para la microscopía directa de los objetos a nanoescala y procesos en líquido.

TEM-fase líquida y STEM aún no son técnicas de análisis de rutina, pero todavía se están desarrollando. El número de parámetros a tener en cuenta es considerable, y es often difíciles de reproducir los resultados experimentales. Por otra parte, los datos cuantitativos es difícil de obtener debido a los efectos que se investigan se entrelazan con los procesos que ocurren como resultado del haz de electrones. El protocolo descrito aquí tiene como objetivo estandarizar el protocolo experimental, lo que representa de esta manera para todos los aspectos de base pertinentes del experimento. Esperamos que este protocolo conducirá a una mejor reproducibilidad del trabajo experimental en este campo emergente.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank E. Arzt for his support through INM. The research was in part supported by the Leibniz Competition 2014.

Materials

Binocular light microscope	Leica	M60 CMO
Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector	JEOL	ARM200F

Liquid flow TEM specimen holder	DENS Solutions	Ocean
Microfluidic syringe pump	Harvard Scientific	PicoPlus
Plasma cleaner	Gatan	Solarus950
Chemicals
Acetone, Rotisolv Plus for HPLC	Sigma-Aldrich	7328.2
Water, chromasolv Plus for HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
Ethanol, Rotisolv HPLC grade	Carl Roth	P076.2
Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm	British-Biocell	EM.GC20
Materials
Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm	DENS Solutions	for Ocean system

Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm	DENS Solutions	for Ocean system


Microfluidic peek tubing	Upchurch Scientific	1570
Plastic Replaceable tips Tweezers
(Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips)	ideal-tek	2ASVR.SA
Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating)	Electron Microscopy Sciences	78322-7Te
Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating)	Electron Microscopy Sciences	78322-2ATe
Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR)	Hamilton	81323
Clean room tissue Sontara Micropure AP (224x224mm)	DuPont	Sontara MicroPure

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Citar este artigo

Hermannsdörfer, J., de Jonge, N. Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e54943, doi:10.3791/54943 (2017).