Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Justus Hermannsd&#246;rfer; Niels de Jonge

doi:10.3791/54943

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Engenharia

Lo studio dei processi dinamici di dimensioni nano oggetti in liquidi di utilizzare la scansione microscopia elettronica a trasmissione

Published: February 05, 2017

doi:

10.3791/54943

Justus Hermannsdörfer¹, Niels de Jonge^1,2

¹INM-Leibniz Institute for New Materials, ²Department of Physics,University of Saarland

Summary

Questo protocollo descrive il funzionamento di un portacampioni flusso di liquido per la scansione di trasmissione microscopia elettronica di AuNPs in acqua, usati per l'osservazione dei processi dinamici nanoscala.

Abstract

I campioni pienamente incorporati in un liquido può essere studiato con una risoluzione spaziale su scala nanometrica con la scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM), utilizzando una camera di microfluidica assemblata nel supporto del campione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e lo stelo. Il sistema di microfluidica è costituito da due microchip di silicio di supporto sottili finestre membrana del nitruro di silicio (SiN). Questo articolo descrive i passaggi fondamentali di caricamento dei campioni e acquisizione dati. Più importante di tutto è garantire che il compartimento liquido viene montato correttamente, fornendo così un sottile strato di liquido ed una tenuta di vuoto. Questo protocollo include anche un certo numero di prove necessarie per eseguire durante il caricamento del campione in modo da garantire un corretto montaggio. Una volta caricato il campione al microscopio elettronico, lo spessore del liquido deve essere misurato. montaggio scorretto può causare un liquido troppo spessa, mentre un liquido troppo sottile può indicare l'assenza di liquido, come quando si forma una bolla. Infine, il protocollospiega come le immagini sono prese e come i processi dinamici può essere studiato. Un campione contenente AuNPs viene ripreso sia in acqua pura e in soluzione salina.

Introduction

Conventional Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) è limitata dalla gamma di campioni appropriati per l'analisi, in particolare i campioni secchi e solidi adatti per il posizionamento in alto vuoto. Tuttavia, molte questioni scientifiche e tecnologiche riguardano materiali e processi in ambiente liquido nanoscala. I campioni pienamente incorporati in un liquido possono ora essere studiati con staminali utilizzando un concetto che implica una camera di microfluidica assemblata nel supporto del campione per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e lo stelo ^1. Questa tecnica di nuova concezione è diventato sempre più popolare, in quanto fornisce una nuova visione importanti processi di vari temi di ricerca, tra cui la crescita, la dissoluzione, e processi di aggregazione delle nanoparticelle ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^6. Non solo i metalli, ma anche biominerals ⁷ e sistemi biologici possono essere studiati ^{^8,} ^{^9,} ^{^10,} ^11. Il caricamento del campione e l'acquisizione di immagini per STEM in fase liquida è diverso per STEM di campioni secchi e comportano un protocollo che richiede una formazione dedicato.

Il sistema microfluidica è costituito da due microchip silicio sostegno del nitruro di silicio finestre (SiN) membrana trasparente per il fascio di elettroni a 200 keV di energia ¹² (vedere Figura 1A). Dettagli delle dimensioni e del trattamento di questi microchip possono essere trovati altrove ^{^12,} ^13. Il campione di solito contiene oggetti su scala nanometrica. In questo lavoro abbiamo osservato nanoparticelle d'oro (AuNPs). I AuNPs sono immobilizzati alla finestra superiore (rispetto ad un fascio di elettroni discendente-traslazione) o galleggiano sapone liquidid. Risoluzione spaziale su scala nanometrica in STEM si ottiene la scansione del fascio di elettroni negli AuNPs e la raccolta di elettroni diffusi trasmessi utilizzando il rivelatore ⁹ anulare scuro Field (ADF). I due microchip sono collocati in una piccola fessura nella punta del titolare TEM flusso di liquido ¹ (il titolare opera sia STEM e TEM, ma è indicato come titolare TEM). Uno dei microchip contiene un distanziatore in modo che un vano liquido è formato tra i microchip. O-ring su entrambi i lati delle due microchip forniscono sigillatura sotto vuoto del vano liquido ¹³ (vedere Figura 1B).

Lo scopo di questo articolo è dimostrare i passi di base di caricamento del campione ed acquisizione dati in modo che gli utenti interessati possono trovare facile accesso a questa nuova tecnica emergente. Un sistema disponibile da un'azienda specifico è utilizzato, ma il protocollo è valido anche per i sistemi di altre aziende. La tecnica èpiù complesso di TEM convenzionale e stelo, e un certo numero di aspetti pratici deve essere considerato quando si lavora con un sistema di supporto liquido ^13. Più importante di tutto è garantire che il compartimento liquido viene montato correttamente, fornendo così un sottile strato di liquido ed una tenuta di vuoto. Pertanto, è molto importante lavorare in modo pulito e prevenire la formazione di polvere durante la preparazione e l'assemblaggio del supporto TEM flusso di liquido. In particolare, gli O-ring e le due microchip di silicio devono essere liberi da ogni contaminazione. Anche piccole particelle di polvere in un'unica dei microchip possono seriamente aumentare lo spessore della cella assemblata, che può impedire il raggiungimento di una risoluzione spaziale utile. Una guarnizione di vuoto è importante che trasmettano o danneggiamento sarà lasciato al microscopio elettronico dopo l'esperimento. Questo protocollo descrive la procedura di caricamento e diverse prove necessarie. Il funzionamento del microscopio elettronico è semplice, but richiede alcuni passaggi aggiuntivi rispetto al microscopio di campioni solidi. Con l'aumento spessori liquidi, più elettroni vengono assorbiti e dispersi dal liquido; una misurazione dello spessore liquido è essenziale. Infine, il protocollo spiega come le immagini sono prese e come i processi dinamici può essere studiato.

Figura 1: cella di flusso liquido per la scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM). (A) Rappresentazione schematica della cella liquido assemblato. Due microchip di silicio con finestre a membrana del nitruro di silicio (SiN) sono posizionati tra due o-ring. Il liquido è racchiuso tra la membrana SiN e quindi è separato dal vuoto al microscopio elettronico. A focalizzato scansioni fascio di elettroni sul campione. Il contrasto è ottenuto da elettroni sparsi. nanoparticelle di oro (AuNPs) sono immobilizzati all'interno del liquido nella membrana SiN ma può anche muoversi nellaliquido. (B) Schema sezione trasversale vista laterale della pila di due microchip con O-ring. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

Figura 2: Procedura di pulizia dei microchip Si. (A) Due bicchieri sono riempiti con 40-60 ml di acetone ed etanolo ciascuno. Microchip (B) il Si sono collocati nel bicchiere riempito con acetone. Il lato con la membrana SiN deve essere rivolto verso l'alto. La riflessione dei due microchip Si mostra chiaramente la scanalatura sul retro due microchip. (C) Dopo 2 min, i microchip Si sono trasferiti al secondo bicchiere riempito con etanolo. Dopo un altro 2 min, i microchip Si sono trasferiti ad un tessuto sterili per l'essiccazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3: il flusso di liquido Transmission Electron Microscopy (TEM) Attrezzature Holder. (A) Il titolare TEM flusso di liquido con tubi di plastica e una siringa per il flusso di liquido. (B) La punta del supporto TEM flusso di liquido rimosso dall'albero del supporto, il coperchio del vano liquido cellulare, O-ring, e due microchip di silicio. Il tubo sporge dal lato sinistro della punta. (C) Il vano cella liquido mostrando un O-ring, lo slot del collocamento microchip. (D) differenti pinzette su una superficie priva di polvere (alluminio). (E) Il coperchio del vano cella liquido con le sue due O-ring. (F) Due microchip di silicio con finestre membrana SiN. A sinistra: il microchip campione senza un distanziatore; a destra: il microchip coperchio con un distanziale 200 micron. (G) Un sistema di pompaggio microfluidica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figuri. 1. Preparazione dei microchip 1. Pulizia dei microchip Preparare uno spazio di lavoro con un basso livello di polvere in una cappa di flusso d'aria laminare con filtro antiparticolato di polvere. Pulire un vetrino al microscopio ottico con un panno privo di fibre e di etanolo puro per il posizionamento e trasporto dei microchip. Posizionare il vetrino su un tessuto camera bianca in una capsula di Petri. NOTA: Evitare l'uso di etanolo tecnico in ogni momento. Selezionare 5 microchip Base (senza un distanziatore) per il posizionamento del campione e 5 microchip con un distanziale 200 nm di spessore. NOTA: Le dimensioni della finestra sono 20 x 400 micron 2 e lo spessore peccato è 50 nm. Poiché vi è una certa tolleranza sulle dimensioni, si consiglia di controllare le dimensioni utilizzando un microscopio ottico. Utilizzare pinzette di carbonio rivestite per rimuovere i microchip dalla scatola di immagazzinaggio e metterli sul vetrino. Afferra i microchip con fermezza ma con cautela sul loro lolati ng. Maneggiare il microchip in modo tale che il lato della membrana peccato è sempre rivolta verso l'alto. Nota: non toccare la membrana fragile SiN sul lato superiore. Anche stare attenti con la manipolazione dei microchip per evitare la rottura dei loro bordi taglienti, che possono causare problemi a causa di particelle di silicio che risiedono sul microchip o di perdite successive. NOTA: formazione per la procedura per rimuovere i microchip dalla superficie adesiva può essere eseguita su (a buon mercato) microchip fittizi. Posizionare i microchip su un tessuto camera bianca in una capsula di Petri. Chiudere il piatto e trasferirlo alla cappa aspirante. NOTA: Le procedure che coinvolgono l'acetone vengono eseguite in una cappa per la sicurezza chimica. Prendete due bicchieri di vetro da 120 ml. Risciacquare una beaker con acetone e l'altra con etanolo per pulirli. Riempire la prima con 40-60 ml di acetone e l'altra con 40-60 ml di etanolo. NOTA: E 'importante utilizzare liquidi HPLC-grade anche per questo passo nel protocollo. Trasferimentomicrochip nel becher con acetone al fine di rimuovere lo strato di resist protettivo. Spostare delicatamente il bicchiere a mano per lavare efficacemente i microchip, ma attenzione a non trasformare i microchip a testa in giù – vedi figura 2. Dopo 2 min, togliere i microchip e rapidamente trasferirli nel becher con l'etanolo. spostare delicatamente il bicchiere a mano con etanolo per 2 minuti per rimuovere eventuali residui di strato resistere. Coprire il becher con un foglio di alluminio e trasferirlo al banco da lavoro flusso d'aria laminare. NOTA: Non lasciare che i microchip asciugare durante il trasferimento per evitare il deposito di detriti. Rimuovere i microchip dal bicchiere e metterli su un nuovo tessuto per camere bianche. Lasciare asciugare per qualche minuto e trasferire i microchip sulla luce vetrino da microscopio nella scatola di Petri. NOTA: I microchip bagnate possono facilmente capovolgere intorno, girare a testa in giù, o un bastone per le pinzette quando viene rilasciato. Ciò può essere evitato prescantare microchip dolcemente sulla carta da filtro e tirando le pinzette di distanza in direzione orizzontale. Chiudere la capsula di Petri e trasferire i microchip al filtro plasma. Posizionare il vetrino con i microchip nel più pulito al plasma. Eseguire un programma di pulizia 5 min a rendere la superficie della membrana idrofilica in nitruro di silicio e di togliere idrocarburi. NOTA: impostazioni adatte applicate per il nostro più pulito al plasma sono: 70 mTorr, il flusso di gas di 11,5 SCCM per O 2 e 35.0 SCCM per Ar, obiettivo di 50 W in avanti radiofrequenza (RF), gamma RF 5 W, e Max riflessa RF. Qualsiasi plasma in grado di indurre una carica superficiale è adatto. Mettere il vetrino con il microchip di nuovo nella capsula di Petri, chiudere il coperchio, e trasferirlo al microscopio ottico. Esaminare i microchip sotto un microscopio ottico per eventuali rotture della membrana o particelle di sporco rimanenti. Faccia particolare attenzione con le aree della finestra e verificare la presenza di piccole macchie che indicano arupture della membrana. Elimina microchip con membrane danneggiate. Chiudere la capsula di Petri e riporlo nel workbench flusso d'aria laminare. 2. Preparazione del campione sul microchip Preparare una soluzione acquosa AUNP (citrato stabilizzata) mescolando piccole quantità di soluzioni di verifica contenenti rispettivamente 30 nm di diametro, AuNPs citrato stabilizzato ad una concentrazione di ~ 3 M. Posizionare i microchip su una superficie pulita e appiccicosa in una scatola di trasporto per la deposizione delle gocce applicazione / campione. Posizionare una goccia (1-2 ml) della soluzione campione sul lato della membrana SiN del microchip plasma pulito fresco (utilizzare un microchip senza distanziatore) e lasciare asciugare la soluzione nel workbench flusso laminare. NOTA: Questa procedura può essere ripetuta per aumentare la concentrazione di AuNPs sulla membrana SiN. Applicare 1 ml di acqua deionizzata al microchip per la rimozione di sale e / o tensioattivi. Dopo 30 s, accuratamenterimuovere la gocciolina di acqua con carta da filtro. Lasciate che i microchip asciugare all'aria nel workbench flusso d'aria laminare. NOTA: un numero sufficientemente ampio di AuNPs avrà aderito al microchip e non verrà lavato via in acqua più. Utilizzare i microchip campione preparato entro 4 ore, come SiN perde le sue proprietà superficiali rese idrofile nel tempo, che può causare il liquido comportarsi diverso durante un esperimento. Nota: fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori dettagli. Utilizzare una scatola di trasporto chiuso per lo stoccaggio ed il trasferimento dei microchip. 2. Preparazione del titolare il flusso di liquido TEM Pulizia del titolare TEM flusso di liquido Pulire tutti gli strumenti (pinze e un cacciavite) che sarà in contatto con parti sotto vuoto usando acetone ed etanolo in un bagno ad ultrasuoni e porle sulla superficie senza polvere fornita da un pezzo di nuova alluminio posta sul banco di lavoro. Il lavoro con i guantiper evitare la contaminazione del titolare TEM flusso del liquido. NOTA: Gli strumenti non devono essere ampiamente puliti se si è sicuri che siano puliti per il lavoro con le parti di vuoto. Guanti possono essere evitati se si è in grado di gestire l'apparecchiatura senza toccare le parti vuoto. Posizionare il supporto TEM flusso liquido sotto il microscopio ottico binoculare in modo tale che la punta del supporto contenente la camera del liquido può essere osservato. Vedi Figura 3. Rimuovere il coperchio della punta titolare e posizionarlo sulla superficie senza polvere. NOTA: Il coperchio titanio è sensibile ai graffi provocati da materiali più duri come le pinzette. Si consiglia di utilizzare una pinzetta con rivestimento polimerico per i materiali sensibili. Preparare almeno 1-2 ml di acqua pura (HPLC). NOTA: Se uno non usa liquido HPLC-grade, allora è consigliabile controllare che i liquidi utilizzati non contengono micro particelle che potrebbe portare a zoccoli del sistema di flusso; filter il liquido, se necessario con un filtro micro-pori. Utilizzare una siringa di vetro (1 mL) per lavare l'intero sistema di flusso con 0,5 mL di acqua pura. Si raccomanda di utilizzare un sistema di pompa a siringa microfluidica. Utilizzare una pipetta e / o carta da filtro per rimuovere il liquido venga espulso nel vano cella liquido. Testare tutti i tubi per il flusso del liquido. Essiccare la punta titolare successivamente su carta da filtro e / o una pipetta. Utilizzare il microscopio ottico per controllare che la punta del supporto è pulita e asciutta. Se necessario, lavare la punta del supporto con acqua o etanolo per rimuovere eventuali residui solidi che potrebbero essere stati lasciati dalla soluzione essiccata. Rimuovere pezzi di polvere o residui di fibre pure. Rimuovere con attenzione questi pezzi con una pinzetta, evitando di graffiare la superficie del titanio. Controllare anche all'interno delle scanalature O-ring e rimuovere i resti di liquido con un piccolo pezzo di tessuto camera sterile. NOTA: Se il titolare non diventa pulita con questa procedura, allora è consigliabileper rimuovere la punta dal supporto e pulirlo in acetone per 2 minuti in etanolo per altri 2 minuti utilizzando un bagno ad ultrasuoni. Ispezionare tutte le altre parti della punta (O-ring, coperchio e viti) sotto il microscopio ottico e rimuovere la polvere, fibre, ecc … NOTA: Di tanto in tanto, piccoli pezzi provenienti dalle viti o microchip Si devono essere rimossi. Se necessario, pulire brevemente le parti vuoto con HPLC-etanolo. Il coperchio e le viti possono essere puliti con gli ultrasuoni, come spiegato per la punta. Evitare di posizionare gli O-ring di frequente in etanolo, in quanto può rendere gli O-ring fragili nel tempo, diminuendo la tenuta al vuoto. Il sistema è gestito senza grasso per vuoto, ma se si verificano problemi di tenuta, grasso per vuoto può essere utilizzato. Reinserire gli O-ring nelle rispettive scanalature del supporto e verificare che si adattano e non sporgono su qualsiasi lato della scanalatura. Mantenere il titolare TEM flusso di liquido privo di polvere fino a quando il caricamento del campione (ad esempio,., Coprendolo con un foglio di alluminio). Assemblaggio del supporto TEM flusso di liquido NOTA: La seguente procedura descrive la procedura di caricamento di microchip in un supporto campione con orientamento ottimale per STEM. In questa configurazione, il microchip base con il campione sarà microchip superiore una volta trasferito nel microscopio. Vedere la Figura 4. Per TEM, la risoluzione spaziale massimo è ottenuto con il fondo della cella liquido rispetto ad un fascio di elettroni verso il basso itinerante. Così, i microchip sarebbe montato viceversa. Utilizzare pinzette curve per afferrare il microchip campione sul lato lungo e posizionarlo all'interno della fessura (tasca) nella punta del titolare TEM flusso di liquido. Tenere il lato SiN rivolto verso l'alto. Controllare il corretto posizionamento del microchip nella fessura utilizzando un microscopio ottico binoculare. NOTA: Se l'O-ring sotto il microchip non è posizionato correttamente, il microchip può sporgere fROM slot. Mettere una goccia di 0,3 ml di liquido filtrato per l'esperimento sul microchip campione utilizzando una micropipetta. Se necessario, fissare il microchip in posizione con le pinzette, come le forze capillari della goccia possono tirare il microchip fuori dalla sua tasca. Utilizzare pinzette capovolta curve prendere la seconda microchip (quella con lo strato distanziatore). girare con cautela il microchip a testa in giù. Posizionare il distanziale microchip sul microchip base nella fessura. NOTA: Questa procedura deve essere fatto in modo sufficientemente rapido per evitare l'essiccamento della goccia sul microchip campione. Controllare il posizionamento corretto utilizzando un microscopio ottico binoculare, mentre lo spostamento di un pezzo di materiale che riflette la luce sotto la punta del portacampioni. Entrambi microchip devono essere allineati esattamente parallelo per ottenere la migliore sovrapposizione delle finestre SiN. NOTA: Nel caso in cui le finestre non si sovrappongono, i microchip può essere riposizionata spingendo su un lato con una punta dile pinzette, ma evitare di spostare i microchip troppo, come la membrana peccato può essere danneggiata facilmente. Alcuni microchip sono dotati di una configurazione incrociata (finestra di una microchip è perpendicolare alla finestra nell'altro microchip); questa configurazione facilita l'allineamento dei due microchip ancora riduce anche il campo visivo al microscopio elettronico. Prendere la parte anteriore del coperchio della camera campione con le pinzette e capovolgerla. Senza toccare i microchip, posizionare il lato posteriore del coperchio sulla punta. Lentamente aprire le pinze in modo tale che il coperchio poggia unicamente sul ramo inferiore della pinzetta. abbassare con cautela il coperchio finché non riposa sui due microchip. Rimuovere le pinzette. Ricontrollare l'allineamento delle finestre di entrambi i microchip. Se necessario rimuovere il coperchio, regolare il posizionamento dei microchip, e posizionare nuovamente il coperchio. Posizionare le viti e fissarli nei loro luoghi abituali. Controllare l'allineamento delle due finestre. iof necessario, togliere di nuovo le viti e regolare i microchip. NOTA: Non fissare le viti troppo stretto, in quanto ciò potrebbe causare danni. Un sigillo di vuoto si ottiene quando le viti appena stringere. Controllare la tenuta avviando un flusso di liquido attraverso il sistema utilizzando una portata di 4 ml / min. Se nessuna colatura è osservato su entrambi i lati della punta, questa è una buona indicazione della tenuta al vuoto. Trasferire il titolare della stazione di pompaggio a vuoto e verificare la tenuta del vuoto. Il livello di vuoto dovrebbe raggiungere almeno 10 -5 mbar entro 5 minuti di pompaggio. NOTA: Si consiglia di testare la stazione di pompaggio con un supporto manichino prima dell'uso. Trasferire il supporto al microscopio elettronico nella sua custodia per evitare che raccogliere la polvere. NOTA: Ogni supporto commerciale è dotato di una custodia. 3. STEM di un campione di liquido Regolazione del microscopio elettronico per STEM </strong> NOTA: Il funzionamento del microscopio elettronico descritto in questo protocollo si basa su procedure standard che possono essere trovati nel manuale utente. Il protocollo descrive dettaglio necessaria oltre le procedure standard per l'acquisizione dei dati su campioni di liquidi. Avviare il microscopio con modalità STEM allineati. Nel Campione di laboratorio, inserire un campione costituito da una pellicola di carbonio sottile con AuNPs. Regolare le impostazioni del microscopio STEM come segue: impostare la corrente sonda 0,18 nA e la convergenza semi-angolo del fascio di elettroni per 20 mrad selezionando uno spot di 4C e l'apertura obiettivo di 30 micron. Selezionare una lunghezza di fotocamera da 8 CM. Prendere nota della densità di corrente indicato misurata lo schermo a fluorescenza, mentre è inserito il rilevatore automatico di documenti. Rimuovere il supporto del campione. NOTA: Questo valore di corrente è necessario in seguito per valutare lo spessore del liquido. Avviare il flusso di liquido con acqua pura. Non superare un flusso di 2microlitri / min. Inserire il supporto TEM flusso di liquido al microscopio elettronico e iniziare l'evacuazione. Controllare sia l'indicazione di vuoto della camera di prevuoto e la durata di evacuazione. Se il livello di vuoto è standard e la durata della procedura di pompaggio non supera il tempo di evacuazione normale (di circa 1 min) per un fattore di due, inserire il supporto. Aprire la valvola fascio quando il vuoto della camera del campione principale è nella gamma che permette l'apertura. Inserire il rilevatore ADF premendo il pulsante ADF. NOTA: Questo protocollo si riferisce ad un rivelatore ADF posizionato sopra lo schermo di fosfori del microscopio elettronico. Impostare il microscopio in modalità di acquisizione delle immagini continua un'immagine con dimensioni di 512 x 512 pixel, un tempo di pixel di permanenza di 2 ms, e un ingrandimento di 20.000. Ricerca per la finestra SiN traducendo la fase del direzioni x ed y. NOTA: I microchip blocchino le elettroni che passano attraverso il campione verso il rilevamentoo; segnale è visibile solo la posizione del SiN. Vedere la Figura 5. A volte, è più facile trovare la finestra di SiN visualizzando la schermata di fluorescenza. Una volta che la finestra è stata trovata, regolare le impostazioni di contrasto e luminosità (utilizzando le rispettive manopole) in modo che il bordo della finestra diventa visibile. Spostare il bordo rivolto verso il centro del campo di vista premendo i tasti xey traduzione del portaoggetti. Premere il pulsante di reset della lente dell'obiettivo. NOTA: La luminosità deve essere sostanzialmente ridotto rispetto ad un campione sotto vuoto a causa della forte dispersione nel liquido. Procedere grossa attenzione spigolo sul bordo della finestra SiN regolando la posizione verticale (z-traslazione) del portaoggetti. Verificare che la posizione del campione è all'altezza eucentrica ruotando la fase del 5 ° e ruotandola indietro. Caratteristiche del campione e l'angolo della finestra di SiN non dovrebbero spostare a bassi ingrandimenti. <br/> NOTA: Chiudere la valvola fascio se non si utilizza il microscopio, poiché la scansione nella stessa posizione per un tempo più lungo può causare danni campione e la formazione di bolle Regolare la posizione verticale come necessario per posizionare il bordo della finestra al centro dell'area di visualizzazione di nuovo. Conservare la posizione della fase utilizzando il pulsante vendite di software. Spostarsi in una posizione in cui piccoli pezzi di rottami o di altri oggetti di alto contrasto (ad esempio, AuNPs) sono presenti traducendo la fase del direzioni x ed y. Regolare la messa a fuoco della lente dell'obiettivo in modo che tutti gli oggetti appaiono nitide a fuoco. Prendere nota della densità di corrente misurata a schermo fosforo visibile attraverso il software operativo, indicante la corrente trasmessa attraverso il supporto liquido e attraverso l'apertura del rivelatore ADF. Calcolare lo spessore della cella liquido utilizzando l'equazione 1. Procedere solo se lo spessore del liquido è stata determinata e non supera 3 micron. <br /> NOTA: Lo spessore della cella liquido può essere determinata dal rapporto tra la densità di corrente misurata con e senza il campione usando la seguente equazione 14 Equazione 1 con t SiN lo spessore della membrana di nitruro di silicio amorfo e acqua t lo spessore dello strato di acqua. Il cammino libero medio lunghezze pari a l SiN = 0,79 micron del peccato, e = l di acqua = 3.0 micron di acqua per l'apertura semi-angolo di 35 mrad 14 del rivelatore. Osservare attentamente il liquido a visualizzazioni ridotte per garantire che le bolle di gas non sono presenti. bolle di gas possono essere evitati utilizzando flusso di liquido continuo e sonda di corrente inferiore a 0. 5 nA. Tradurre lo stadio in direzioni X e Y fino a un'area che contiene almeno 20 ettari AuNPss stato trovato. Impostare le dimensioni dell'immagine a 1.024 x 1.024 pixel, il tempo di permanenza dei pixel a 19 ms, e l'ingrandimento di 400.000. Acquisire immagini di AuNPs aderito alla membrana SiN premendo il tasto di acquisizione. NOTA: una volta le immagini sono state ottenute in cui i AuNPs sono visibili con un forte contrasto e spigoli vivi (vedi figura 6), si può essere certi che l'esperimento sia configurato correttamente. Nel caso in cui si verifichino problemi imprevisti, non procedere con l'esperimento, ma fare in modo di risolvere la causa. STEM della dissoluzione del AuNPs Rimuovere il supporto TEM flusso di liquido dal microscopio e arrestare il flusso di liquido. Preparare almeno 1 ml di una soluzione 0,1 M di cloruro di sodio in acqua per HPLC in una siringa di vetro. Regolare il sistema di flusso ad una velocità di 20 ml / min e lavare l'intero sistema di flusso con 0,3 ml di soluzione salina. Utilizzare carta da filtro per raccogliere il liquido che viene espulso sullaaltra estremità del tubo. Successivamente, ri-regolare il sistema di flusso di 2 ml / min. Controllare l'integrità della finestra SiN utilizzando un microscopio ottico binoculare. Se non si osservano perdite, reinserire il titolare TEM flusso di liquido nel microscopio. Controllare l'indicazione di vuoto della camera di pre-vuoto e la durata di evacuazione. Se il livello di vuoto è standard e la durata della procedura di pompaggio non supera il tempo di evacuazione normale (di circa 1 min) per un fattore di due, inserire il supporto Spostare il back stage del microscopio nella sua posizione precedente utilizzando la posizione di fase memorizzata. Impostare il microscopio in modalità di acquisizione delle immagini continua un'immagine con dimensioni di 512 x 512 pixel, un tempo di pixel di permanenza di 2 ms, e un ingrandimento di 20,000X. Regolare il contrasto, la luminosità, messa a fuoco, e l'altezza eucentrica, come descritto nei punti 3.1.7-3.1.9. Trovare una posizione di interesse traducendo la fase del direzioni x ed y. Impostare le dimensioni dell'immaginea 1.024 x 1.024 pixel, il tempo di permanenza dei pixel a 2 ms, e l'ingrandimento a 500.000. Registrare una serie di immagini STAMINALI manualmente premendo il tasto di acquisizione volta l'immagine precedente è stata registrata. NOTA: Le AuNPs iniziano a dissolversi non appena il fascio elettronico viene scansionata sul campione. Le particelle di fuori della zona irradiata non sono interessati e possono essere osservati immediatamente dopo. Il timestamp è memorizzato nell'intestazione dell'immagine. È anche possibile utilizzare il software per la raccolta automatica di una serie di immagini in un film. Smontaggio e pulizia del supporto TEM dopo l'esperimento Quando gli esperimenti TEM in fase liquida sono completate e il supporto viene svincolato dal microscopio elettronico, pulire il tubo, la camera del liquido, e le sue componenti al fine di rimuovere eventuali particelle solide o sale restando che potrebbero influenzare futuri esperimenti. Allentare la vite posteriore leggermente in modo che sia ancora risoltonel suo alloggiamento, ma il coperchio può essere rimosso facilmente. Allentare la vite anteriore, rimuoverlo, e metterlo in un ambiente privo di polvere. Togliere il coperchio e collocarlo in un ambiente privo di polvere per la conservazione. Rimuovere le due microchip dalla tasca. Separarle immergendoli accuratamente in acqua o in soluzione rimanente dell'esperimento. Posizionare i microchip su carta velina con il lato della membrana SiN verso l'alto e lasciarli asciugare all'aria per ulteriori analisi. Rimuovere gli O-ring e pulire le rispettive scanalature con acqua HPLC-grade. Conservare gli O-ring in un ambiente privo di polvere. Utilizzare una siringa di vetro (5 mL) per svuotare tutti i tubi (ingresso e uscita), ciascuno con 5 mL di acqua HPLC. Raccogliere il liquido con un piccolo becher posto sotto la punta titolare TEM. Dopo il lavaggio, utilizzare una pipetta e / o carta da filtro per rimuovere il liquido residuo dal vano liquido. Ispezionare la punta del titolare TEM e rimuovere i residui come i bordi rotti del micro siliconechip, fibre o polveri. Se il sale è ancora visibile, ripetere la procedura di pulizia. Rientro degli O-ring per le loro scanalature. Conservare il supporto TEM e dei suoi componenti in un ambiente privo di polvere. Procedura alternativa al 3.2: STEM di muoversi nanoparticelle d'oro NOTA: una procedura di montaggio diverso è necessario per studiare il movimento di AuNPs in un liquido. Omettere passo 1.2. Caricare i AuNPs sul microchip di silicio immediatamente prima di inserirli nel supporto TEM al punto 2.2. Mantenere il campione coperto da uno strato liquido in ogni momento, al fine di evitare un forte attacco dei AuNPs alla membrana SiN. Le altre fasi del protocollo sono le stesse. Una serie di immagini stelo è ottenuto nel passaggio 3.2.6. Figura 4: Montaggio del Titolare il flusso di liquido TEM. (A) Il vano cella di liquido con °e O-ring più piccolo collocato nella sua scanalatura. L'inserto mostra la vista dall'alto. (B) Il microchip è posizionata nella rispettiva presa. L'inserto mostra la vista laterale in angolo tale che il microchip è visibile dalla riflessione della luce. (CD) Una goccia della soluzione viene aggiunta al microchip. (EG) Posizionamento del microchip copertura. (HI) Posizionamento del coperchio del vano cella liquido. (J) Fissaggio del coperchio con le due viti. (K) Assemblato liquido titolare TEM flusso. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5: posizionamento iniziale e messa a fuoco utilizzando Micrografie staminali. (A) Per individuare la finestra di peccato, la scena è spostata verso il sig brillantinale. Il microchip di silicio è abbastanza sottile per alcuni elettroni di passare attraverso vicino alla finestra. (B) Il bordo della finestra SiN focalizzata mostra alcuni AuNPs appaiono luminoso sulla finestra membrana SiN scuro (meno scattering). Il bordo del microchip è luminosa a causa di dispersione eccessiva. (C) La messa a fuoco avviene in un angolo della finestra SiN. Le immagini mostrano sotto-messo a fuoco, messa a fuoco, e le situazioni sopra-fuoco. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Representative Results

Il titolare TEM flusso liquido è stato utilizzato per studiare il comportamento di AuNPs in liquido. AuNPs erano stabilmente immobilizzati sulla membrana SiN in acqua pura e sono stati ripresi con risoluzione nanometrica utilizzando STEM fase liquida (Figura 6). Eccellente contrasto è stato ottenuto l'oro fortemente scattering. La densità di corrente sullo schermo fosforo misurato per un campione secco era di 20 pA / cm², mentre è pari a 8 pA / cm² con il supporto TEM flusso del liquido inserito. Con l'equazione 1, t acqua = 2.4 ± 0.5 micron, molto più grande di quanto ci si aspettava in base allo spessore distanziale di 200 nm. Tuttavia, lo spessore non è troppo grande per la rappresentazione delle AuNPs con risoluzione spaziale nanometrica. Lo spessore liquido era più spesso del 200 nm impostato dal distanziale a causa rigonfiamento delle membrane peccato, non planarità dei microchip, e detriti che risiedono sui microchip. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "1"> Per l'acqua pura, le AuNPs mantengono la loro forma durante l'imaging 16, anche se i prodotti radiolisi reattivi (e – aq, H •, H +, OH •) provenienti dalla interazione del fascio di elettroni con acqua può ossidare atomi d'oro singole, portando ad un cambiamento della forma della AuNPs 15. Tuttavia, quando il sistema di flusso liquido è stato utilizzato per introdurre ioni cloruro in un secondo esperimento, la stabilità dei AuNPs cambiato. Gli ioni cloruro sono in grado di stabilizzare atomi d'oro ossidato in forma di tetrachloroaureat, AuCl 4 -. La figura 7 mostra che i AuNPs lentamente dissolti nel corso di una serie di time-lapse immagini STEM, simili ai risultati riportati in precedenza 16. Per la dose di elettroni utilizzato, ci sono voluti ~ 300 s per sciogliere i 30 nm AuNPs dimensioni. I movimenti di AuNPs Tardi r sono stati studiati in un terzo esperimento (Figura 8). Prima dell'esperimento, il titolare TEM flusso di liquido è stata pulita per rimuovere eventuali tracce di sale. A differenza del primo esperimento, un approccio alternativo preparazione del campione è stata utilizzata per realizzare un collegamento più debole delle AuNPs alla membrana SiN 14. In questo esperimento, la soluzione AUNP è stata posta sul microchip silicio e montato nel supporto TEM flusso di liquido senza lasciare che la soluzione asciugare. In questo modo, i AuNPs facilmente rimossi dalla membrana SiN su immagini alla dose utilizzata. Alcuni dei AuNPs spostato lontano dal campo visivo nelle soluzioni all'ingrosso, mentre i rimanenti AuNPs rimasti entro il campo visivo in prossimità della finestra di SiN. sono stati osservati movimenti di questi AuNPs, e alla fine hanno agglomerati. Dopo un po ', questi agglomerati anche staccati dalla membrana SiN e portate fuori dal campo visivo e nella soluzione. S copi "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figura 6: la scansione microscopia elettronica a trasmissione (STEM) Micrografia di AuNPs 30 nm di diametro in testa di uno strato di acqua pura. L'immagine mostrata è un'area selezionata dell'immagine originale. La dimensione dell'immagine è 1.024 x 1.024 pixel, il tempo di permanenza dei pixel è di 19 ms, la dimensione dei pixel è stato 0,73 nm, e l'ingrandimento era 400,000X. La dose di elettroni era quindi 7,1 x 10 4 e – / nm². La densità di corrente misurata sullo schermo fosforo era 8 pA / cm 2, per cui lo spessore del liquido è stata calcolata pari a 2.4 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7: Serie Time-lapsedi Micrografie stelo di AuNPs a Saline. (AD) immagini estratte dalla serie time-lapse di immagini STAMINALI ad intervalli di 30 s. I AuNPs gradualmente dissolvono in un liquido come conseguenza della presenza di ioni cloruro. Il tempo di pixel di permanenza è stato di 2 ms, il lasso di tempo della serie lasso di tempo è stato 1,75 s, la dimensione dei pixel è stato 0,44 nm, e l'ingrandimento era 500,000X. La dose di elettroni per ogni immagine era 1,2 x 10 4 e – / nm². Lo spessore liquido era 2,4 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 8: STEM Micrografia di AuNPs movimento in acqua pura. (A) membrana SiN con AuNPs, molti dei quali sono selezionati con le frecce. (B) le tracce di movimentodei AuNPs selezionati (vedi A). Alcuni AuNPs allontanarsi dal campo di vista durante il tempo di imaging. I restanti AuNPs si muovono lateralmente lungo la membrana peccato e iniziano agglomerazione. Dopo aver raggiunto una dimensione di cluster critica, si inviano dalla membrana e si allontanano dal campo di view.The tempo pixel di permanenza è stato di 1 ms, il lasso di tempo è stato di 0,52 s, la dimensione dei pixel è stato 1,8 nm, e l'ingrandimento era 120,000X. La dose di elettroni per ogni immagine era 3,5 x 10 2 e – / nm² e lo spessore liquido era 2,4 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il protocollo descritto consente STEM di AuNPs in un liquido, compreso l'osservazione dei processi dinamici. L'assemblaggio del supporto è una tecnica facile da imparare. Tuttavia, diversi aspetti devono essere considerati quando si lavora con il titolare TEM flusso di liquido. Per esempio, bordi rotti di microchip Si o particelle di grandi dimensioni sugli O-ring possono causare perdite della cella liquido. D'altra parte, le particelle più grandi (> 200 nm, per esempio, polvere o detriti Si) sulla membrana SiN può portare ad un aumento dello spessore della cella di liquido, che conduce ad un basso contrasto imaging o ad una bassa risoluzione spaziale e può anche causare finestre peccato rompere. Importante, residui di sale o altre sostanze chimiche possono influenzare l'esito degli esperimenti in modo indesiderato. Pertanto, è fondamentale che le diverse fasi di preparazione del campione e gruppo porta vengono eseguiti accuratamente e in un ambiente pulito e privo di polvere.

Lo spessore del ce liquidoll determina la risoluzione ottenibile, nonché il contrasto delle immagini ottenute ^17. Questo spessore può essere regolato tramite distanziali situato su uno dei due microchip Si. A seconda delle dimensioni del campione, diversi spessori della cella liquido può essere realizzato. Per lo studio della AuNPs, è possibile utilizzare piccoli distanziatori (200-500 nm), mentre intere cellule eucariotiche necessitano grandi distanziatori fino a 5 micron. Lo spessore della cella liquido viene ulteriormente influenzata dalla sporgenza dei finestrini membrana SiN risultanti dalla differenza di pressione tra la cella liquido e il vuoto circostante. Questo effetto diventa più pronunciato con le finestre membrana SiN più grandi. Pertanto, al fine di ridurre al minimo lo spessore della cella di liquido, si raccomanda di utilizzare piccole finestre membrana SiN. Nel caso è difficile trovare una sovrapposizione tra due piccole finestre, che può essere montato in una configurazione incrociata utilizzando un diverso microchip base. configurazioni alternative largely prevenire rigonfiamento e sono composti da un microchip ¹⁸ o membrana monolitici Windows supportati da colonne ^19, ma quelli svantaggi presentano per quanto riguarda il caricamento del campione. Uno degli aspetti più impegnativi della tecnologia attuale è la mancanza di un controllo preciso sulla spessore liquido. Spesso, il liquido è molto più spesso di quello che ci si aspetta dalle dimensioni distanziali utilizzati, come è stato mostrato qui. Diversi gruppi utilizzati camere chiuse liquidi ^{^4,} ^{^20,} ^{^21,} ^22; questi sistemi hanno alcuni vantaggi rispetto risoluzione spaziale, come lo spessore liquido può essere ridotto inducendo una bolla nel liquido. In alternativa, le finestre SiN possono essere costretti a collassare, portando ad un livello di liquido diluente. In terzo luogo, il recinto di altre finestre sottili esiste (ad esempio, grafene) ^23, con conseguente anche nei liquidi molto più sottilidi quello che è possibile con il sistema descritto in questo protocollo. Tuttavia, è impossibile flusso liquido in tali sistemi.

Come per qualsiasi tecnica di microscopia alta risoluzione, deve essere considerato un certo numero di aspetti sperimentali. L'aspetto più importante è l'interazione del fascio elettronico con il liquido o il campione. Oltre ai danni da radiazioni, che limita la risoluzione spaziale ottenibile per vari campioni solidi ^24, i campioni liquidi sono inoltre influenzati dal fascio di elettroni generati prodotti radiolisi ^{^15,} ^25. Dal momento che questi prodotti possono influenzare l'esperimento, l'interpretazione dei dati accurati e disegno sperimentale sono essenziali ^26. Le impostazioni microscopio devono essere scelti in base agli obiettivi di uno studio particolare. STEM ADF è più potente per le nanoparticelle di imaging di un elevato numero atomico (Z) in grandi spessori della cellula liquido, WHILe TEM fornisce un migliore contrasto su materiali a basso-Z ed è in genere più veloce, ma richiede più sottili strati liquidi ^3. Invece di utilizzare il rilevatore di ADF, la (BF) rilevatore di campo luminoso è talvolta usato per l'immagine della cella di liquido, in quanto BF STEM è vantaggioso per l'imaging materiali a bassa-Z in strati spessi ^27. Con l'aumento dello spessore della cella liquido, è necessaria più attuale. Tuttavia, questo aumenta anche le concentrazioni di prodotti radiolisi e aumenta il danno di radiazione. Va inoltre osservato che una inversione di contrasto si osserva nel rivelatore ADF per liquidi molto spessi (> 10 micron per l'acqua).

Le condizioni liquide sono state modificate tra i nostri esperimenti rimuovendo il supporto dal microscopio e scambiando sia il campione e il liquido. Oltre a modificare la concentrazione di sale, è facilmente possibile modificare altre proprietà del liquido che scorre in diversi liquidi (ad esempio, uno puòusare soluzioni tampone al fine di impostare un pH specifico ¹⁶ o possono introdurre soluzioni organiche o altri additivi). E 'anche possibile cambiare il liquido mentre il supporto è ancora inserito nel microscopio fluendo liquidi attraverso il sistema microfluidico. Tuttavia, in questo caso, non è noto al momento che punto il liquido cambia campione. E 'anche degno di nota che i microchip di supporto elettrodi sono disponibili, in modo da esperimenti su scala nanometrica elettrochimica possono essere effettuate ^28.

Gli oggetti di studio non sono limitati a AuNPs in acqua, ma un'ampia varietà di campioni possono essere studiate usando il protocollo descritto sopra, compresa la silice, ossido di titanio, e polimeri. Se i movimenti degli oggetti sono troppo veloci per catturare in un'immagine all'interno l'acquisizione, la viscosità può essere ridotto di un ordine di grandezza usando una miscela di 50% glicerolo e acqua al 50%.

Dai punti suddetti,una serie di vantaggi, possibilità, e anche svantaggi diventa evidente. Quando si lavora con stelo in fase liquida, gli inconvenienti più importanti da considerare sono che: 1) ogni esperimento è influenzata dall'interazione dinamica del fascio elettronico con l'intero campione (l'oggetto sotto osservazione, il liquido e le membrane SiN); 2) la manipolazione del campione è noioso, ed è spesso difficile ottenere un sottile strato liquido perché il campione o il microchip contiene alcune particelle di dimensioni micrometriche; 3) lo spessore liquido solito varia notevolmente dallo spessore previsto fissato dal distanziatore; e 4) la risoluzione spaziale e di contrasto dipendono fortemente dallo spessore del liquido e la differenza tra la densità cambiamento dell'oggetto sotto osservazione e il liquido.

Attualmente, esistono ampi metodi per la microscopia di oggetti in un liquido con risoluzione spaziale nanometrica. La microscopia elettronica in ghiaccio amorfo è una tecnica potente ^29,ma le procedure sperimentali coinvolti sono delicati, non tutti gli esperimenti consentono la preparazione del campione in ghiaccio, ed esperimenti risolte nel tempo sono impossibili. Microscopia a ³⁰ ^X-ray, ³¹ potrebbe in linea di principio essere utilizzato, ma ha una risoluzione spaziale limitata e non è ampiamente disponibile nei laboratori. Atomic microscopia a forza in un liquido è stata stabilita, ma è una superficie tecnica solo ^{^32,} ^{^33,} ^{^34,} ^35. La microscopia ottica non presenta risoluzione spaziale sufficiente. Attualmente, microscopia elettronica in un liquido sembra la tecnica più potente per microscopia diretta di oggetti e processi su scala nanometrica in liquidi.

TEM in fase liquida e STEM non sono ancora tecniche di analisi di routine, ma sono ancora in via di sviluppo. Il numero di parametri da prendere in considerazione è considerevole, ed è often difficile riprodurre i risultati sperimentali. Inoltre, dati quantitativi è difficile da ottenere perché gli effetti in esame si intrecciano con i processi che si verificano come risultato del fascio di elettroni. Il protocollo qui descritto si propone di standardizzare il protocollo sperimentale, che rappresentano quindi per tutti gli aspetti di base rilevanti di questo esperimento. Ci auguriamo che questo protocollo porterà ad una migliore riproducibilità del lavoro sperimentale in questo settore emergente.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank E. Arzt for his support through INM. The research was in part supported by the Leibniz Competition 2014.

Materials

Binocular light microscope	Leica	M60 CMO
Scanning transmission electron mircoscope with spherical aberration corrector	JEOL	ARM200F

Liquid flow TEM specimen holder	DENS Solutions	Ocean
Microfluidic syringe pump	Harvard Scientific	PicoPlus
Plasma cleaner	Gatan	Solarus950
Chemicals
Acetone, Rotisolv Plus for HPLC	Sigma-Aldrich	7328.2
Water, chromasolv Plus for HPLC	Sigma-Aldrich	34877-2.5L
Ethanol, Rotisolv HPLC grade	Carl Roth	P076.2
Gold colloid citrate stabilized, diameter 30 nm	British-Biocell	EM.GC20
Materials
Base silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness and dimensions of 20 µm x 0.40 mm	DENS Solutions	for Ocean system

Spacer silicon microchips with silicon nitride membranes of 50 nm thickness, dimensions of 20 µm x 0.40 mm, and spacer thickness of 200 nm	DENS Solutions	for Ocean system


Microfluidic peek tubing	Upchurch Scientific	1570
Plastic Replaceable tips Tweezers
(Anti-Magnetic Anti-Acid Stainless Steel body with ESD PVDF (SV) tips)	ideal-tek	2ASVR.SA
Teflon coated bent steel tweezers (EMS SA with "PTFE" Coating)	Electron Microscopy Sciences	78322-7Te
Teflon coated broad beak steel tweezers (EMS 2A "PTFE" Coating)	Electron Microscopy Sciences	78322-2ATe
Hamilton syringe, 1 mL, gastight (Model 1001 TLLX SYR)	Hamilton	81323
Clean room tissue Sontara Micropure AP (224x224mm)	DuPont	Sontara MicroPure

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Citar este artigo

Hermannsdörfer, J., de Jonge, N. Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (120), e54943, doi:10.3791/54943 (2017).